丹参2C-甲基-D-赤藓醇 2,4-环焦磷酸合成酶的cDNA的全长克隆概述.docVIP

分类 年 级 07级 成 都 中 医 药 大 学 药学院学士学位论文 丹参2C-甲基-D-赤藓醇 2,4-环焦磷酸合成酶的cDNA的全长克隆 姓名：马晓惠 指 导 教 师：黄璐琦研究员 高伟副教授 申请学位级别：学 士 专业名称：中药学 论文提交时间：2011 年5 月 论文答辩时间：2011 年 6 月 学位授予单位：成都中医药大学 答辩委员会主席： 评阅人： 成都中医药大学药学院 2011年 5月 目 录 目录 中文摘要 英文摘要 综述…………………………………………………… 1.1丹参研究概况……………………………………………… 1.2丹参酮类化合物的药理作用……………………………… 1.3丹参酮生物合成途径……………………………………… 1.3.1 IPP和DMAPP的合成……………………………… 1.3.2 GGPP合成…………………………………………… 1.3.3 GGPP下游合成……………………………………… 1.4 MECPS研究现状…………………………………………… 1.5本课题研究的意义及思路………………………………… 1.5.1研究意义 1.5.2研究思路及技术路线 第2章 实验材料和方法……………………………………… 2.1 实验材料…………………………………………………… 2.1.1 实验材料来源……………………………………… 2.1.2 菌株和质粒………………………………………… 2.1.3 主要试剂…………………………………………… 2.1.4 主要仪器设备……………………………………… 2.2 试验方法…………………………………………………… 2.2.1 植物材料培养及处理方法………………………… 丹参毛状根的悬浮培养…………………… 植物材料的处理…………………………… 丹参总RNA提取（CTAB-LiCl法）与检测… 2.2.2 引物设计及合成…………………… 2.2.3 第一链cDNA的合成………………………………… 2.2.4 cDNA末端快速扩增（RACE）……………………… 2.2.5 T-A连接、转化、蓝/白菌落筛选及阳性克隆PCR鉴定……………………………………………………………………… 2.2.6 SmMECPS的全长cDNA………………………………… 第3章 实验结果…………………………………………………… 3.1 丹参总RNA…………………………………………………… 3.2 5’RACE…………………………… 3.3 3’RACE………………………… 3.4 SmMECPS全长序列及序列分析………………………… 第4章 讨论与结论……………………………………………… 参考文献 致谢 摘要 丹参药用历史悠久，是一种常用的中药，其主要成分包括丹酚酸类水溶性成分和丹参酮类脂溶性成分。丹参酮为松香烷型二帖类化合物，现代药理研究表明丹参酮类化合物具有心脏保护、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、保肝等多重药理作用，是丹参中最主要的有效成分之一。挖掘与丹参酮类化合物生物合成相关的关键酶，并对编码这些关键酶基因进行深入的功能分析及其调控研究，逐步阐释丹参中丹参酮形成的分子机制并加以利用，将是改良丹参种质资源品质、提高丹参酮含量和开展丹参酮类化合物代谢工程的重要途径，对于推动丹参现代化具有重要意义。丹参酮类化合物生物合成途径中编码很多关键酶的基因如SmAACT、SmHMGS、SmHMGR、Sm DXS、Sm DXR、Sm CMK、SmIPPI、SmGGPPS、SmCPS、Sm GPPS和Sm KSL已克隆获得。 2C-甲基-D-赤藓醇 2,4-环焦磷酸合成酶（简称为MECPS）是MEP途径中第五个关键酶，对丹参酮生物合成具有重要作用。本研究以丹参毛状根为材料,用Ag+和酵母提取物（YE）刺激丹参毛状根，研究丹参酮类生物合成途径中编码MECPS的基因的克隆，通过设计特异引物进行快速cDNA末端扩增(RACE)，首次从丹参中克隆得到了含1062bp的 MECPS全长cDNA序列（SmMECPS），该序列具有完整的开放阅读框 (ORF)，且3’端有poly(A)尾。SmMECPS开放阅读框(ORF)分析表明，基因编码区共编码261个氨基酸的蛋白。为后期对SmMECPS蛋白异源表达、基因的功能鉴定和分