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大肠杆菌表达系统资料.ppt
其他表达系统 四、高效表达目标基因的战略和技术 溶氧调控型 采用大肠杆菌丙酮酸甲酸裂解酶基因 pfl 启动子,硝基还原酶基 因nirB 启动子或透明颤菌血红蛋白基因 vgb 启动子构建表达载 体。这些启动子中都含有对氧响应的调节因子 fnr 的作用位点。 在富氧条件下转录被抑制,在贫氧或微氧条件下转录被激活。 其他表达系统 溶氧调控型 大肠杆菌 GJ100 有透明颤菌血红蛋白基因(vgb)启动子控制下 的 T7 RNA 聚合酶基因表达质粒, vgb 基因的转录是受环境溶氧 浓度调控的,在贫氧条件下 vgb 基因的启动子被激活。 因此,用大肠杆菌GJ100 作为宿主时,表达系统调控方式为贫氧 诱导型, 菌体发酵时的溶氧浓度可以通过控制搅拌转速和通气量 加以调节,与其他调控模式相比更适合于产业化生产过程。 其他表达系统 生物素调控型 用大肠杆菌生物素操纵子及其调控区构建表达载体,菌体生长过程 中生物素会不断消耗,当浓度到达 2ng/ml 以下时启动子被激活。 能够在没有外界的物理,化学信号的介入条件下自动诱导表达目的 基因是这类表达载体的特点,其缺陷是不容易精确控制自动诱导的 时刻。 其他表达系统 强化转录终止的必要性 外源基因在强启动子的控制下表达,容易发生转录过头现象,即 RNA 聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的 DNA 序列,形成长短不一的 mRNA 混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达,其原因如下: 转录产物越长,RNA聚合酶转录一分子 mRNA 所需的时间就相应增加,外源基 因本身的转录效率下降; 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或 DNA功能区域,如选择性标 记基因和复制子结构等,则 RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其 它生物功能,甚至导致重组质粒的不稳定性; 过长的 mRNA 往往会产生大量无用的蛋白质,增加工程菌无谓的能量消耗; 更为严重的是,过长的转录物往往不能形成理想的二级结构, 从而大大降低外 源基因编码产物的翻译效率 终止子 强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌 rRNA 操纵子上 的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌体 DNA 上的 Tf。 对于一些终止作用较弱的终止子,通常可以采用二聚体终止子串联的特 殊结构,以增强其转录终止作用 终止子 核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频 率,而且在很大程度上还与 mRNA 的翻译起始效率密切相关。 大肠杆菌细胞中结构不同的 mRNA分子具有不同的翻译效率,它们之间的差别有时可高达数百倍。 mRNA 翻译的起始效率主要由其 5‘ 端的结构序列所决定,称为核糖体结合位点(RBS) 核糖体结合位点 核糖体结合位点 大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素: 位于翻译起始密码子上游的 6–8 个核苷酸序列 5’ UAAGGAGG 3’ 即Shine-Dalgarno(SD)序列,它通过识别大肠杆菌核糖体小亚 基中的 16S rRNA 3’ 端区域 3’ AUUCCUCC 5’ 并与之专一性结合 将mRNA 定位于核糖体上,从而启动翻译; 翻译起始密码子,大肠杆菌绝大部分基因以 AUG作为阅读框架的 起始位点,有些基因也使用 GUG 或 UUG 作为翻译起始密码子 SD 序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成 基因编码区 5’ 端若干密码子的碱基序列 核糖体结合位点 核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD 序列的影响 一般来说,mRNA 与核糖体的结合程度越强,翻译的起始效率就 越高,而这种结合程度主要取决于 SD ( UAAGGAGG)序列与 16S rRNA 的碱基互补性,其中以 GGAG 四个碱基序列尤为重要。
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