分子伴侣groesl在大肠杆菌中的克隆.pdfVIP

维普资讯 了 ( ． 微 生 物 学 报 37(5)：344～348，1997 Acta ~ crotnologlca Sinica 分子伴侣GroESL在大肠杆菌中的克隆、 表达及分离纯化 ． 旦 塑．塑蛳 张青宋大新 陈永青… 复(旦大学微生物系￡海200433)Q ．f2-1 摘 要 将含分子伴侣CaoESL基因的DNA片段，通过在合适的酶切位点进行酶切，将该基 因克隆人高表达载体pKC220，含该表达质粒的工程菌经42C热诱导后，分子伴侣CaoESL基 因在大肠fF菌中获得了高教表达，其中，分子伴侣蛋白CaoEL的表达量 占细菌总蛋白的40％， 其辅助蛋白GroES的表达量占细菌总蛋 自的 l5％：同时，建立了较简单的分离纯化路线，通过 硫 酸铵沉淀，D】BAB_52柱层析、SephadexG-50凝胶过滤等方法得到纯化的分子伴侣蛋 白 子 “～。大肠杆菌的热休克蛋 白GroESL参与许多蛋 白质的折叠 组装以及跨膜运输0。，属 于分子伴侣的一种，由单体分别为 60kD的GroEL和 l0kD左右的GroES两种成份组成． 在一定条件下，l4个GroEL单体分子和 7个GroES单体分子形成聚合体，其中GroEL分 子排列成双层饼状，每层为 7个单体组成，而 7个 GroES单体分子排列成单层环状，与 GroEL十四聚体的一端结合。GroESL通过催化ATP水懈提供能量，瞬时维持其它蛋白质 在折叠过程中间态的稳定，阻止了聚集，帮助其它蛋白质形成正确构象 ～。 外源基因在大肠杆菌中高效表达时，往往形成无活性又不可溶的包涵体，包涵体大多 是蛋 白质在过量表达过程中不正确折叠形成的。由于分子伴侣可以促进外源蛋 白质 的正 确折叠，在基因工程实际应用中具有广 阔的前景。本研究主要是在大肠杆菌中高效表达 分子伴侣GroESL，并且获得了大量分子伴侣GroESL的纯蛋白，为进一步研究分子伴侣的 作用机制打下基础。 1 材料和方法 1．1 酶厦试剂 限制性内切酶及 DNA连接酶等工具酶均购 自美国Promega公司，DEAE-521~J自 英国Whalraan公司，SephadexG-50购 自美国Pharmacia公司，其它化学试剂均为分析纯 ·国家 自然科学基金资助项 目 +·复旦大学遗传学研究所。 … 联 作者 ． 本文于I996年7月15日收到 维普资讯 5期 周 颖等：分子伴侣GroESL在大肠杆菌冲的克隆、表达及分离纯化 345 产 品 。 1．2 质粒及菌株 带有 GroES和 GroEL基因的质粒 pOt39 由美 国Utah大学 OlivierEayet博士惠赠： 表 达 质 粒pKC220 带有 热敏调控 型强启动 子P，为本 实验 室保存：大肠杆 菌 HB101[supFA4hsdS20recA13ara14proA21acYlgalK2rpsL20xyl一5mtl—I】用作基 因克隆及表 达受体菌，为本实验室保存。 1．3 基因工程的一般操作 有关质粒DNA的抽提，酶切 连接和转化等基因工程一般操作均按 Sambrook等方法 进行。 1．4 SDS和蛋白质浓度测定 不连续变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳 (SDS)采用Lammile系统 “q， 分离胶浓度 12．5％。电泳后用考马斯亮蓝R-250染色。蛋白质浓度测定采用Bradford方法I】，以小牛血清 白蛋白(BSA)作为标准。 1．5 菌体 的诱导表达 将带有GroESL基因的高表达质粒经转化至大肠杆菌HB10l中，将转化子于 2×YT 培