顺铂与卡铂对骨瘤细胞株作用的分子机制研究.pdfVIP

中文摘要 顺铂与卡铂对骨肉瘤细胞株作用的分子机制研究 摘 要 目的：通过顺铂与卡铂对骨肉瘤细胞(MG．63)的细胞毒 性和分子机制的对比研究，为顺铂、卡铂治疗骨肉瘤的合理 性选择提供实验依据。 方法：1．细胞悬液的制备和药物加入：在37。C，体积 分数为5％C02、95％空气、饱和湿度下C02孵箱内闭式传 代培养骨肉瘤细胞株，用传代后第3天处于指数增殖期细胞 备用。取定量的骨肉瘤细胞混悬液与不同浓度(1 u∥ml、 10 ug／ml、50ug／ml、100ug／m1)顺铂和不同浓度(40ug／ml、 80 ug／ml、160 72h． 2．细胞形态学的观察 在细胞生长过程中定时用倒置显微镜观察。 3．MTT法测定 清液，加二甲亚砜150ul／孑L，待结晶溶解后，用全自动酶标仪 细胞毒性指数值(CI)，CI=(对照组A值．试验组A值)／对照组 A值×100％。 4．制作生长曲线 根据处理一的结果制作顺铂和卡铂对骨肉瘤细胞株 (MG．63)的生长曲线，并求出两者的IC50。 中文摘要 5．流式细胞分析： 将浓度为0．4×106的细胞悬液12ml和IC50浓度的顺铂、 将培养液连同用EDTA和胰蛋白酶消化下的骨肉瘤细胞一 起离心、清洗，经染色后行细胞周期分析，了解细胞的周期 分布及细胞的增殖活性。 6。免疫印迹：观察顺铂和卡铂作用后的人成骨肉瘤细 胞MG一63的PCNA、Bcl．2、Bax的表达。 结果：1．细胞在倒置显微镜下的形态学变化： 倒置显微镜下观察到骨肉瘤细胞(MG．63)与IC50顺铂、 卡铂培养基作用24h后细胞增值数量减少，少量细胞坏死漂 浮，48h后漂浮细胞明显增多，一部分胞膜破裂细胞坏死， 存活细胞颜色晦暗，胞浆内颗粒增多增粗，72h后部分细胞 漂浮，大部细胞溶解。 2．MTT实验 不同浓度顺铂和卡铂对MG一63细胞分别作用24h、48h 和72h后，对细胞的生长均起到抑制作用。不同时间组及不 同浓度组与对照组相比，顺铂和卡铂对MG．63细胞的生长 抑制作用差异均具有显著性(pO．05)，且随着药物浓度的 增加及作用时间的延长抑制率也随之增加，呈剂量．时间．效 应关系。根据生长曲线显示对骨肉瘤细胞株卡铂的浓度约需 25倍于顺铂才能产生相似的生长抑制效应。 3．细胞周期分析显示 不同浓度顺铂和卡铂作用骨肉瘤细胞24h、48h和72h 后收集细胞流式细胞仪分析结果显示与对照组相比，在细胞 各期均未见明显凋亡峰，细胞周期各期所占比例无明显变 中文摘要 化，抑制作用呈剂量依赖性。 4．免疫印迹结果显示 PCNA在顺铂组和卡铂组骨肉瘤表达与对照组相比较 明显下降，顺铂和卡铂组Bax表达较对照组明显增加，Bcl．2 表达略减少。 结论：1．本研究在倒置显微镜下观察到骨肉瘤细胞形 态学变化现象显示在一定范围内随时间的增加药物对细胞 的杀伤作用逐渐增强；根据细胞周期分析结果，顺铂和卡铂 对骨肉瘤细胞株的细胞毒性作用随它们的浓度增加而增强， 肯定了顺铂、卡铂的抗癌活性呈剂量依赖性，总体具有时间 ．剂量一效应关系。 2．与对照组相比，在细胞各期均未见明显凋亡峰，细 胞周期各期所占比例无明显变化，说明顺铂和卡铂对肿瘤细 胞生长各期均有抑制作用，对于骨肉瘤细胞来说，卡铂具有 与顺铂类似的效应。 3．根据生长曲线显示对骨肉瘤细胞株卡铂的浓度约需 25倍于顺铂才能产生相似的生长抑制效应，而对肿瘤细胞 产生相同抑制效果的卡铂用量所产生的副反应则较顺铂为 小。 4．增殖细胞核抗原(PCNA)，是反映细胞增殖状态的 良好指标，本实验中PCNA在顺铂组和卡铂组骨肉瘤表达 与对照组相比较明显下降，表明顺铂和卡铂对骨肉瘤细胞株 抑制增殖作用明显。 5．细胞凋亡是受到基因控制的细胞死亡形式， Bcl．2 基因是笫…个被发现的细胞凋亡抑制基因， Bax具有抑制 Bcl一2，促进细胞凋亡的作用，Bcl．2与Bax两者之间的比例