PCR临床应用及肝炎病毒核酸检测概述.ppt

PCR的临床应用肝炎病毒的核酸检测 检验科 郭楠 PCR（聚合酶链反应）原理 荧光PCR原理 PCR 循环 第一步 – 加热变性 靶序列 靶序列 PCR 循环 第二步–引物与靶序列退火 靶序列 靶序列 Primer 1 Primer 2 Biotin Biotin 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 引物与解为单链的DNA上互补序列杂交在一起，称之为退火。(55℃) PCR 循环 第三步 - 引物延伸 靶序列 靶序列 Primer 1 Primer 2 Biotin Biotin 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ Taq DNA Polymerase 在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs为原料（底物），从引物的3’端A开始, 沿着5’→3’的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。(72 ℃) 第1个PCR循环完成后 靶序列 靶序列 Biotin Biotin 30次循环后靶序列扩增的数量 No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 21 2 2 22 4 3 23 8 4 24 16 5 25 32 6 26 64 20 220 1,048,576 30 230 1,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon PCR原理:实质就是体外基因复制技术 Mg2+ dCTP dGTP dUTP dATP Taq DNA聚合酶 AmpErase Primer 靶序列 加热变性95°C 靶序列引物退火55°C 引物延伸72°C 定性PCR测定的是扩增的终点（平台期） 定量PCR测定的是扩增的指数扩增期; 定量PCR与定性PCR测定的区别 5’ 3’ R Q 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收， 所以检测不到荧光，此种现象称为荧光共振能量转移。 荧光PCR原理 – TaqManTM技术 λ 荧光定量PCR技术原理 感染性疾病的诊断 遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断 法医学鉴定 荧光定量PCR的临床应用 早期诊断 病情评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察、指导 荧光定量PCR在病原体检测中的应用 肝炎病毒定量检测 性病病原体检测 结核杆菌检测 优生优育(TORCH)相关项目检测 乙型肝炎病毒结构及特点 HBsAg：是HBV感染的主要标志 HBsAb：保护性抗体 HBcAg：仅存于感染的肝细胞核内， 　　　 一般不存在于血循环中 HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM 　　　 提示HBV处于复制状态 HBeAg：HBV复制及强感染性的指标 HBeAb：有一定的保护作用，预后良好 乙肝病毒DNA参考值：＜500copys/ml 乙肝病毒DNA正常值定量检测阳性（大于正常值），说明乙肝病毒复制活跃，血液中乙肝病毒含量高，乙肝病毒DNA传染性强，且传染性与数值的大小成正比。 乙肝病毒DNA正常值定量检测阴性（小于正常值），说明乙肝病毒复制得到抑制，复制缓慢甚至停止复制.血液中乙肝病毒DNA含量低，乙肝病毒DNA传染性弱。 HBV-DNA与“两对半” 1.“两对半” ：机体的免疫反应状态； 2. “大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能反应体内病毒复制水平与感染程度。 检测的是HBV本身的遗传物质—DNA，是病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。 3.HBsAb(＋)、 HBcAb(＋)、 HBeAb (＋)三抗体阳性与 HBV DNA (＋)结果解释。 HBV-DNA定量检测的临床意义 1. HBV-DNA定量与HBV复制水平及传染性 2. HBV-DNA定量与乙肝药物疗效 病毒复制水平的降低是治疗的关键 a.干扰素 b.拉咪呋啶 HBV感染与干扰素治疗 干扰素治疗前： a: 治疗前HBV低水平复制者对干扰素的反应性明 显优于高水平复制者。 b: 治疗前HBV DNA 含量特别高者大多没有疗效。 c: HBsAg转阴的几乎都是那些治疗前血清HBV DNA 含量较低者。 HBV感染与干扰素治疗 干扰素治疗中： a: 病毒复制水平迅速降低者，有望治愈。 b: 相反，治疗期间HBV DNA复制水平下降较慢， 或下降幅度较小，