《植物组织培养技术(三)》.pptVIP

第七章 愈伤组织（callus）的形成和形态发生 一般情况下，植物组织均能诱发形成愈伤组织； 由外植体形成愈伤组织，标志着植物组织培养的开始。 一、愈伤组织的诱导 利用植物组织培养技术，促使细胞脱分化的过程。 B 外植体的制备 外植体的灭菌处理； 对灭菌后的外植体进行修整。除去所有坏死的组织，将材料切成5mm厚度的圆柱形或方形小块。应注意把握组织块的大小，太大会增加染菌的机会，太小又会增加损害完整细胞的比例使之难以发生细胞分裂，且不易操作。一般情形下，每9cm培养基上，接种5-6块外植体。 2）植物生长调节物质 常用的生长素是：2，4-D，IAA，NAA； 常用的细胞分裂素是：KT，6-BA。 在多数情况下用2，4-D就能成功诱导愈伤。 二、愈伤组织形成的过程 外植体中已分化的活细胞，在外源激素的诱导下通过脱分化后形成愈伤组织。 从单个细胞或一块外植体形成典型的愈伤组织，这一过程被大致划分为三个时期（诱导期、分裂期和形成期）。 接种的外植体的细胞通常处于静止状态，因为它们都是成熟细胞。 在诱导期，通过一些刺激因素和激素的诱导作用，使细胞合成代谢活化，细胞内物质代谢旺盛，但是细胞大小和形态没有多大变化，所以外观无明显特征。 诱导期的长短，因植物种类和外植体的生理状况和外部因素而异，如胡萝卜的诱导期要好几天，新鲜的菊芋块茎则只要22h。 生长在不同关照条件下的植株，对其诱导分裂的难易程度也不一样。一般生长在弱光下的植株比生长在强光下的植株的外植体易于诱导分裂，且分裂频率高。 分裂期是指细胞脱分化，不断增生子细胞而形成愈伤组织的过程。 外植体在细胞分裂期间，其形态结构和生理生化都发生显著变化。 1.细胞的数目迅速增加。如胡萝卜培养7天后，细胞数可增加10倍。 2.每个细胞平均鲜重下降。这是由于细胞鲜重的增加不如细胞数目的增加快的缘故。 3.细胞体积小，内无液泡，如同根尖和茎尖的分生组织细胞特性。 4．细胞的核和核仁增大到最大。 5.细胞中RNA含量减少，而DNA含量保持不变。 6. 随着细胞不断分裂和组织生长，细胞的总干重、蛋白质和 核酸含量大大增加，新细胞壁的合成极快。 分裂期 细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，颜色浅而透明 进入形成期后，细胞的体积不再减少，并保持相对稳定。 细胞分裂由原来局限在组织外缘的平周分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂，结果形成瘤状或片状的拟分生组织。分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心，或者进一步分化为维管组织。 出现了各种类型的细胞。 三、愈伤组织的培养 3 继代培养（传代）： 愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养，这个过程叫做继代。 通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保持在不分的增殖状态。然而，如果让愈伤组织留在原培养基上继续培养而不继代，它们则不可避免地发生分化，产生新的结构。 一般在25-28℃下进行固体培养时，每隔4-5周进行一次继代培养。 四 、愈伤组织的增殖方式 一般来说，愈伤组织的增殖生长只发生在不与琼脂接触的表面，而与琼脂接触的一面极少细胞增殖，只是细胞分化形成紧密的组织块。它是愈伤组织表面或近表面瘤状物生长的结果。 愈伤组织之间的质地有显著不同，有的很松脆，有的很坚实，且这两类愈伤组织可互相转变。其方法是：加入高浓度的生长物质，可使坚实的愈伤组织变为松脆。反之，减低或除去生长物质，则松脆的愈伤组织可以转变为坚实。 生长旺盛的愈伤组织一般呈奶黄色或白色，有光泽，也有淡绿色或绿色的；老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。 五、 愈伤组织的形态发生方式 愈伤组织分生细胞团可进行再分化，即进行形态建成，可再产生完整的植株。 形态建成：外植体在适宜的培养条件下经脱分化、分化或直接发育成各种形态完整的植物体的过程。 指细胞或愈伤组织培养物，通过形成不定芽或根再生成植株，这是细胞和组织培养中常见的器官发生方式。 愈伤组织的器官发生顺序有四种情况：（1）愈伤组织中有根或芽器官的分别形成，即无根的芽或无芽的根；（2）先形成芽，再在芽伸长后，在其茎的基部长出根而形成小植株，多数植物属这种情况；（3）先产生根，再从根的基部分化出芽而形成小植株。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物；（4）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株小植株。 2．胚状体的发生。 指由培养细胞诱导分化出的似胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。 胚状体形成完整植株，与不定芽和根发生相比，有以下三个特征： 1）具有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端与根端，而不定芽或不定根都为单向极性； 2）胚状体的维管组织与外植