高效菌筛选方法及策略精要.pptVIP

克隆子筛选与鉴定 B 利用乳糖操纵子lacZ’ 基因筛选克隆子 具有完整乳糖操纵子的菌体能翻译β-半乳糖苷酶（Z）、透性酶（Y）和乙酰基转移酶（A），当培养基中含有X-gal （5-溴-4-氯-3-吲哚- β-D-半乳糖苷）和IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）时，可产生蓝色沉淀物，使菌落成蓝色。当目的基因插入后lacZ’ 基因不能表达，因此，带有目的基因的重组子菌落呈白色，而没有转入目的基因的菌落呈兰色。 克隆子筛选与鉴定 2 克隆子的进一步鉴定 用上述方法筛选的克隆子，难免得到一些假克隆子，为进一步鉴定克隆子的真假，可采用限制性内切酶分析、分子杂交、PCR扩增和DNA测序、目的基因转录及翻译产物检测等方法。 第二节 基因工程菌构建策略 自1973年Jackson等人首次提出基因可以人工重组，并能在细菌中复制以来，基因工程作为一个新兴的研究领域得到了迅速发展，取得了喜人的成绩。 因各种环境条件和生物因子的限制，细菌的进化是相当缓慢的而且没有一定的方向，因此通过基因工程促进细菌的遗传进化以满足生物修复工程的需要。 1.优化污染物的降解途径 （1）重组互补代谢途径： 系列酶（不同菌共代谢） 有机污染物 小分子化合物 缺点：降解速率慢，因为污染物代谢产物在不同降解菌间的跨膜转运是耗能过程，对细菌来说这是一种不经济的营养方式。另外，某些污染物的中间代谢产物可能具有毒性或对代谢活性有抑制作用，如不能被迅速代谢利用，积累后将对整个代谢过程产生抑制作用。 因此对这些细菌的降解基因进行重组，将分属于不同细菌个体中的污染物代谢途径组合起来来构建具有特殊降解功能的超级降解菌，可以有效的提高微生物降解能力，从而提高生物修复效率。 抑制剂 脱氯 ohb 脱卤素基因 联苯双加氧酶 （bph A） 氯代苯甲酸(CBA) 多氯联苯 （PCBs） O2 异戊二烯酸 重组体Bph:ohb CO2 +H2O 进一步降解 硝基芳香化合物，如炸药，即2，4，6-三硝基甲苯（简称TNT） 引入甲苯完整降解质粒pWWO-Km 假单胞菌 甲苯 TNT 氨基甲苯 硝基甲苯 构建微生物可以利用TNT 为唯一碳源和氮源生长 1.优化污染物的降解途径 （2）改变污染物代谢产物流向 污染物降解过程中由于抑制性中间代谢产物的生成或中间产物进入截止式代谢产物途径而抑制了污染物降解酶活性，使得污染物降解效率不高或降解不彻底。因此可以考虑将细菌对污染物的中间代谢产物流向进行某些改进，使抑制性中间产物不产生或尽量转化，从而提高污染物降解速率。 1.优化污染物的降解途径 （3）拓宽酶的专一性 许多有毒有害有机物，如芳香烃、多氯联苯、氯化烃等，其代谢反应由多组分氧化酶催化进行。这些关键酶的底物专一性阻碍了有机物代谢，如多氯联苯异构体等，如何拓宽这些酶的底物范围，是研究的方向。 多氯联苯—联苯降解菌：不能氧化甲苯 甲苯—苯降解菌：不能利用联苯为碳源生长 两者双氧合酶编码基因的遗传结构、大小和同源性相似，将两种酶不同组分的编码基因“混合”，可以构建复合酶体系，以拓宽其底物专一性。 （4）拓宽酶的