人脂肪来源干细胞构建组织工程化脂肪组织体内外实验.pdf

博士学住论文 人脂肪来源干细胞构建组织工程化 脂肪组织的体内外实验研究 博士研究生：张云松 指导教师；高建华 摘 要 ￡背景及目的] 随着修复重建外科的发展，自体组织移植及人工材料替代修复软组织缺损 成为重要的治疗手段，尽管这能有效地改善受区的组织缺损状况，但自体移植 物的来源，血供及其供区的继发畸形都限制了它的使用。此外，还有其它多种 多样的方法也被尝试，包括自体真皮移植，自体脂肪细胞游离移植，胶原注射， 人工材料填充等等。但这些方法的治疗效果也不十分理想：例如人工材料的移 植排斥反应，游离脂肪移植后的吸收且吸收率难以预测等。尽管修复软组织缺 损的方法较多，却难以完全满足临床的需要。组织工程技术的出现为临床上更 好的解决组织缺损等难题提供了一个新的思路。 组织工程技术能以少量种子细胞，经体外扩增后与生物材料复合，修复较 大的组织或器官缺损，重建生理功能，为真正实现无损伤修复组织缺损和真正 意义上的形态、结构与功能重建开辟了新的途径。组织工程学的发展需要几个 必备的因素，即：(1)可获得的种子细胞，并能控制其生长和组织形成；(2) 结构精确的三维支架，以适合再造需要的组织量和形状，而且与细胞具有良好 的组织相容性； (3)适宜的微环境，能提供充分的血供和营养，维持细胞增殖 和组织功能。 中文摘要 目前已证实脂肪组织中存在类似骨髓基质细胞的间充质千细胞，且被命名 为脂肪组织来源的干细胞(AS∞。这种干细胞经证实同样具有体内外多向分化诱 导潜力，如能向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞及心肌细胞定向转 化，对多种组织的损伤具有良好的修复作用，而且取材方便，获取量大，不易造 成供区继发畸形等，已作为组织工程研究中的重要种子细胞。 组织工程常用的支架材料分为天然材料和人工合成材料。天然材科包括： 天然多糖类材科有纤维素、甲壳索、透明质酸等；天然蛋白质类材料有胶原和 纤维蛋白等；人工合成的材料有聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)或两者聚合物 聚乳酸一聚乙醇酸(PLGA)、聚四氟乙烯、羟基磷灰石、聚乙烯醇、海藻酸盐等． 依据他们各自特点，被不同程度地应用于组织工程的研究。由于应用脂肪细胞 组织工程技术修复软组织缺损近期才引起学者们的关注，故而用于构建脂肪组 织工程有效的生物材料支架研究不多，主要为可降解的多孔泡沫，如PLGA、透 明质酸、膨体聚西氟乙烯等，然而，究竟何种材料能成为脂肪组织工程种子细 胞的理想载体尚不十分明确，且关于脂肪组织工程的研究国内报道甚少，对这 一课题进行广泛深入的探讨具有深远意义。 本实验研究了人ASCs向脂肪组织的体外定向诱导分化能力，同时判断种 子细胞AScs与I型固态胶原支架及纤维蛋白胶可注射支架复合后在体内构建组 织工程化脂肪组织的可能性。以寻找适宜的脂肪组织工程种子细胞载体，探索 构建组织工程化脂肪组织的有效方法；另外，对AsCs进行Dil体外荧光标记，观 察该标记物对细胞生物性状的影响，为脂肪干细胞研究寻找理想的细胞标记方 法。 [材料与方法] 一、成人脂肪来源干细胞(ASCs)的分离培养及鉴定 取人吸脂术抽吸物的脂质部分，使用酶消化法进行原代培养，观察细胞形 态及功能变化，细胞传至第3代后供实验用。利用流式细胞仪检测细胞表面部 分与干细胞相关的分子如CD29、CD34、CD44，确定细胞类型；同时对细胞进行 Ⅱ 博士擘住论文 体外定向成脂、成骨诱导分化，并以油红0染色及茜素红染色进行鉴定。 二、脂肪干细胞体外D珏荧光标记及观察标记物对细胞生物性状的影响 荧光染料DiI体外标记ASCs，倒置显微镜及荧光显微镜观察细胞生长情 况及传代后荧光强度的变化：检测细胞标记后成脂能力。使用xrr比色分析 法检测接种细胞增殖率，同时将培养细胞上清液进行乳酸脱氢酶(LDH)含量测 定，检测荧光染料的细胞毒性。 三、以I型胶原固态支架为载体材料构建组织工程化脂肪组织的实验研 究 1．细胞一支架复合物体外生物相容性检测 将脂肪干细胞揍种于支架材料形成复