第十七节血红蛋白的提取和分离(二).docVIP

　　 血红蛋白的提取和分离（二） 主讲：黄冈中学优秀生物教师　王小敏 回顾上节课： 二、实验操作 阅读血液组成成分，思考： 1、血液由血浆和血细胞两部分组成。 2、血细胞中红细胞细胞数量最多，红细胞的含量最高的有机化合物是血红蛋白。 3、该化合物是由2条α-肽链和2条β-肽链构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的亚铁血红素基团。 （一）样品处理 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。 思考1：你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？ 　　　 哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。 1、红细胞的洗涤： 　　①洗涤目的：是去除杂蛋白。以利于后续血红蛋白的分离纯化。 　　②洗涤方法： 　　思考2：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？ 　　防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。 2、血红蛋白的释放： 　　加蒸馏水到原血液体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟。 思考3：加入的蒸馏水、甲苯的作用分别是什么？充分搅拌的目的是什么？ 　　　蒸馏水的作用：使红细胞大量吸水胀裂。 　　　甲苯的作用：溶解红细胞的细胞膜。 　　　充分搅拌的目的：加速红细胞的破裂。 3、分离血红蛋白溶液： （二）粗分离——透析 1、过程：将血红蛋白溶液装入透析袋，置于磷酸缓冲液（pH为7.0）中，透析12小时。 　　在透析过程中，血红蛋白不能通过半透膜，而离子和小分子能够通过半透膜扩散进入磷酸缓冲液中。 2、透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。 （三）纯化——凝胶色谱操作 1、凝胶色谱柱的制作： 　　①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 　　②底塞的制作：橡皮塞打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。 　　注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。 　　③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。 　　④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。 2、凝胶色谱柱的装填 　　装填材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）、20mmol/L磷酸缓冲液 　　“G”：表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。 　　75：表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。 步骤 操作要求 ① 固定色谱柱 色谱柱垂直固定在支架上 ② 计算称量凝胶 根据色谱柱体积计算凝胶用量 ③ 配制悬浮液 凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀 或：凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴 ④ 装填悬浮液 一次性缓慢倒入；轻轻敲打 ⑤ 缓冲液洗涤平衡 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h 注意事项： 　　①凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 　　②装填凝胶柱时不得有气泡存在。因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 　　③洗涤时，液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。 　　④不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。 3、样品加入与洗脱 　　①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 　　②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 　　③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 　　④洗脱：小心加入pH＝7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 　　⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） 注意事项： 　　正确的加样操作：①不要触及并破坏凝胶面。②贴壁加样。③使吸管管口沿管壁环绕移动。 （四）纯度鉴定——聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定（略） 三、操作提示 1、红细胞的洗涤： 　　洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 2、色谱柱的装填： 　　装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。 3、凝胶的预处理： 　　沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡 4、色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。 四、结果分析与评价 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？ 　　观察你处理的血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功