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目录 PCR的原理 PCR的分类 PCR的应用 多聚酶链式反应（PCR：Polymerase Chain Reaction) PCR是由美国科学家穆利斯提 出的一种体外简化条件下模拟 DNA体内复制的DNA快速扩增 的方法，此技术获得1993年诺 贝尔化学奖。 体内DNA的复制体系 Mullis的PCR构思 PCR原理 PCR反应曲线 PCR的操作步骤 PCR反应成分 模板（纯化度、溶度、完整度） PCR反应成分 引物（特异性） 长度为15-30nt，常为20nt 两引物之间的碱基对长度以200-500bp为宜 引物碱基，C+G含量以40-60%为宜 浓度为0.1-0.5 ?mol/L PCR反应成分 Taq DNA聚合酶（Mg2+） PCR反应成分 dNTP 浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。 优点 特异、敏感、产率高、快速、简单、重复性好、易自动化 少量的目的基因 大量的产物 PCR的分类 荧光定量PCR 其PCR扩增原理和普通PCR仪扩增原理相同，只是PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。 梯度PCR PCR技术的应用 研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒和寄生虫检测，诊断 人类基因组工程 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现场标本分析 肿瘤 各种肿瘤的检测 其他 DNA测序 PCR扩增的DNA测序免去了传统克隆测序 传统的细菌培养 模板提取 耗时的的克隆步骤 快速 简便 稳定经济 cDNA文库的构建 经典cDNA文库的构建 不足： 所需的mRNA量大 低丰度表达序列在文库中出现的几率低 工作复杂，限制了基因克隆的速度 基因突变检测 直接测序 最可信和最精确的手段 但繁琐、耗时、费力 方便 快捷 Questions 简述PCR技术的原理 PCR技术的基本原理类似DNA的天然复制过程，由变性-退火-延伸三部分构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，氢键断裂，形成单链DNA； 模板DNA与引物的退火（复性）：温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对，形成局部双链； 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，从引物的5’端向3’端延伸，合成与模板互补的DNA链。 每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量增加一倍。 温度在PCR过程中的影响 变性阶段：变性温度过低，双链模板解链不完全将会导致PCR反应失败；变性温度过高，会影响Taq酶的活性，降低反应效率。 退火阶段：退火温度对应DNA单链与引物结合的特异性与产量。温度过低会引发DNA与引物的错配，影响特异性；温度过高则引物结合效果差，影响产量。 延伸阶段：延伸温度对应TaqDNA聚合酶的最适温度，温度过高或过低都会影响Taq的酶活。 * * PCR仪 冯江朵 饶甜甜 2014.3.14 Kary B. Mullis 变性 退火 延伸 每完成一个循环需要2-4分钟，2-3小时就能将待扩的目的基因扩增放大几百万倍。 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DN DNA结合蛋白类。 DNA模板一般100ng /100?L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 Saiki（1988）将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。 PCR 普通PCR 荧光定量PCR 梯度PCR 原位PCR 反向PCR 多重PCR 普通PCR 一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪，叫传统的PCR仪，也叫普通PCR仪。如果要做不同的退火温度需要多次运行。主要是做简单的，对目的基因退火温度的扩增。该仪器主要应用于科研研究，教学，医学临床，检验检疫等机构。 标记引物 ＰＣＲ 观察 PCR产物 把一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件（温度梯度），通常有12种温度梯度，这样的仪器就叫梯度PCR仪。因为被扩增的不同DNA片段，其最适退火温度不同，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增，就可以筛选出表达量高的最适退火温度，