5.第三节 冷冻蚀刻样品制备技术资料.pptVIP

* * 第三节 冷冻蚀刻复型样品 制备技术 一、样品制作的基本原理 冷冻蚀刻复型法（Freeze Etching Replica）又叫冷冻复型法（Freeze Replica），它是研究细胞膜性结构和核孔形态结构的专门制样技术。它是采用深低温冷冻方法使新鲜的或预固定的样品硬化。这样可大大降低细胞内部结构特别是膜性结构因化学试剂作用时间太长而造成的变化。经冷冻的样品在专门的仪器中，并在特定的温度下（一般是控制在－１000Ｃ）对组织进行割断。在此温度下细胞断裂的特点是有膜性结构的细胞器沿细胞膜脂质双分子层的疏水区把膜分成内外两层，在其断面上有细胞器和其间已冻结成玻璃态的水分。再升温至－900Ｃ，使玻璃态的冰升华，充分暴露 出割断面上各种细胞器的膜结构，这一过程称为蚀刻。 然后以不同的角度在经过蚀刻的断面上喷上一层铂和碳的投影膜，在断面上形成一层复型膜；最后取出经喷镀的样品，把有机组织腐蚀掉，将复型膜捞在铜网上，用透射电镜观察。在复型膜上不仅能观察到细胞器的各种膜结构，而且还能观察到细胞的连接装置，核膜孔、膜内颗粒等。此外，图像的立体感强、分辨率高（可达2.5nm），而且复型膜可长期保存。但用该技术制作样品耗费高，成功率较低，技术程序较复杂，一般不易掌握。 示核 孔 示高尔基复合体和线粒体 二、样品制作前的准备工作 1、仪器设备：冷冻蚀刻仪，封闭式FD-2A型，日本日立公司生产；开放式是用真空喷镀仪（HUS-5GB型与冷却割断装置HFZ-1日立产）配合组成。 2、试剂：2.5%戊二醛（磷酸缓冲液配制）、0.1mol／L磷酸缓冲液(PH7.2～7.4)；20%、30%的甘油-生理盐水（pH7.2～7.4）；腐蚀液（次氯酸钠）、液氮、30％的丙酮水溶液、蒸馏水、光谱纯碳棒和黄金丝或铂丝等。 3、器皿：冰盒、蜡板、双面刀片、解剖器械、牙签、滴管、立体解剖镜、弯头专用镊子、牙科镊子、铝制的提勺等。 HFZ—1冷冻割断装置的组装示意图 FD---2A冷冻蚀刻仪 三、样品制作步骤（以开放式冷冻蚀刻装置为例） 1、样品的取材、固定和防冻处理 ：将实验动物迅速杀死，在1分钟之内取出肝脏等组织，迅速放入预冷的2.5％的戊二醛内，稍固定一段时间后，在蜡板上滴加少量冷固定液，将组织切成细条状，其大小为3×1×1.5mm，再放入2.5％的戊二醛中固定15～20分钟，组织变硬后再对组织进行修块，继续固定3～5小时。然后用0.1mol/L的磷酸缓冲液（PH7.2～7.4）清洗样品0.5～1小时，之后将样品放入25％和30％的甘油——生理盐水混合液中各处理4～6小时。 2、碳棒与铂珠的制备和组装 ：（1）、碳棒的预处理：取长约5～6cm，直径3mm的光谱纯碳棒4段（A、B、C、D），将A、B两段碳棒的一端磨成15度的斜角，C、D两段碳棒的一头磨成直径为1mm，长度约为5mm。（2）、缠绕铂丝：取直径0.1mm的铂丝8～12cm，缠绕到D碳棒磨细的一端的中间区。铂丝在碳棒上一定缠绕紧密，否则会在碳棒上烧成散在的小铂珠（见下图）。 碳棒的安装 及其铂珠的烧结示意图 （3）、碳棒的组装：先将HFZ－1型冷冻割断装置装好（如图）放入HUS－5GB真空喷镀仪的钟罩内的塑料底盘上，将“A”碳棒固定在钟罩内的一个固定电极上，碳棒的150斜面对准割断装置的一个孔道；“C”碳棒固定在对应的可动电极上，使其细端顶在A碳棒斜面的中间，这就是一对碳电极。然后，将“B”碳棒固定到另一个固定电极上，使150的斜面对准另一个孔道，“D”碳棒固定到“B”碳棒对应的活动电极上，使其细端对在“B”碳棒斜面的中间，这是铂电极。碳电极的喷发点与样品表面呈900角，铂电极的喷发点与样品表面呈450角，两个电极喷发点离样品表面为10～11cm。 HUS---5GB真空喷镀仪 （4）、喷发点的调整：将两组电极安装好后，必须用三点一线的方法再细心校正，使喷发点分别对准两隔热板孔和喷碳与喷铂孔道的正中央。否则铂和碳可能喷不到样品的表面上。最后将碳棒可动侧的弹簧调节好，使得弹力大小要适当。如果太松加热后可能短路，碳棒尖端会离开斜面；太紧对应面碳棒的尖端会滑落而不能进行喷镀 。校准完毕将割断装置移出喷镀仪的钟罩。（5）、烧制铂珠：为了提高喷镀效果，要在喷镀前将碳棒上缠绕的铂丝在低真空（10－2～10－3讬）状态下溶化呈珠状。铂珠