酒精相关性肝癌乙肝病毒相关性肝癌线粒体DNA D-loop区测序分析.pdfVIP

中文摘要 酒精相关性肝癌及乙肝病毒相关性肝癌线粒体 DNA D—loop区测序分析 摘 要 6 目的：人类线粒体DNA是一条全长为1 kbp的双链闭环 基因。与核基因组相比，因其缺乏组蛋白保护和必要的损伤 修复系统，又直接暴露于线粒体高氧环境中，易产生氧自由 基等物质，本身又不能合成谷胱甘肽将这些过氧化物有效地 清除，因此线粒体DNA突变在退行性疾病及肿瘤疾病广泛存 在。在包括病毒性肝炎所致肝癌在内的多种肿瘤中，大多数 突变和多态性集中于线粒体DNA非编码区(D。loop区)， 此区含有线粒体DNA的重链和轻链复制起始点，是控制 mtDNA复制和转录的重要区域，在遗传上是高变区。在酒精 相关性肝癌，由于酒精滥用使肝细胞中氧自由基增加，可引 精性肝癌的关系，目前研究甚少。肝细胞病毒除了引起氧化 应激之外，还可能整合进入细胞的染色体DNA当中以发挥进 一步的致癌作用，因此在酒精相关性肝癌及病毒相关性肝癌 中，可能存在致癌机制的差别。本研究拟通过对酒精及病毒 相关性肝癌的癌组织、癌旁组织、术前外周血组织及正常肝 组织的线粒体DNA的D．100p区测序、对比、分析，了解其在 D．100p区的多态性及突变的不同情况，并进一步阐明其在肿 瘤形成和发展中的作用机制，以期为肝癌的发病机制提供可 靠的理论依据。 中文摘要 方法：1研究对象：49例乙肝病毒相关性肝细胞肝癌(以 下称乙肝组)及1 1例酒精相关性(酒精摄入量409／d，持续5 年以上)肝细胞肝癌(以下称酒精组)的癌组织、癌旁组织 (距肿瘤边缘2cm以上，由病理切片确诊)、术前外周静脉血 组织；38例肝血管瘤的正常肝组织作为对照，所有肝癌患者 均为河北医科大学第四医院肝胆外科2007年9月～2008年7月 住院病人，行肝癌根治手术。患者术前未进行任何临床治疗。 病理类型均经河北医科大学第四医院病理科两名主任医师 确诊。 2mtDNA提取：首先利用差速离心方法，去除细胞核， 得到纯化的线粒体组织，以避免核DNA的干扰(通过对人 线粒体DNA全序列和人类核基因组全序列的比较发现， mtDNA的大部分序列在核基因组上都有同源序列，这说明 及血组织的mtDNA分别用相应试剂盒提取，提取后至于 ．20℃保存备用。 3PCR扩增线粒体DNA的D．100p区，上游引物为 凝胶电泳证实后，送往上海生工生物工程技术服务有限公司 测序。 4我们选择49例乙肝相关性肝癌及11酒精相关性肝 癌，术前空腹抽取外周静脉血，测定其AFP及肝功能(ALT、 发光免疫分析(ECL)，原理为在电极表面由电化学引发的特 异性化学发光反应，包括了电化学和化学发光二个过程。 2 中文摘要 ALT、AST、GGT采用测定酶活力的速率法，原理是根据酶 采用终点法。 5使用student’S 分析两组之间年龄，性别等临床资料的差别，并探讨D—loop 区域多态性及变异与临床资料的关联性。 结果：1乙肝组与酒精组临床资料对比：年龄、TP、ALB、 TBIL、DBIL、GGT在两组之间无显著性差异。 P=0．000)在两组之间有显著性差异。乙肝组肝功能损害较 重，AFP升高明显。 2在60例患者全长均为982bp测序序列中，与剑桥序 列相比，发现91个多态性位点(血组织、癌旁组织、癌组 织三者一致，但与剑桥序列不符，称之为多态性)，多态率 为9．27％。 3在152位点，乙肝组49例患者有18例含有碱基C， 肝组49例患者有15例未含有A，酒精组11例患者均含有A， 正常组均无G，P=0．047。 中10个位点为碱基错配的点突变，另一位点突变次数高达 18次(18／60)，变异形式包括单个碱基的缺失及插入，其中 有一例为大片段缺失。在正常肝血管瘤对照组中，未发现任 中