Ch03目基因获取.pdf

第三章 目的基因的获取 邢万金 内蒙古大学生命科学学院生物学系 第一节 基因组DNA片断化 一、限制性内切酶法 用限制性内切酶把目的基因片段从基因组DNA 中切出来 限制酶 Southern blotting 1. 优点 带有粘性末端，产物可以直接与载体连接 2. 缺点 往往带有不需要的DNA片段 目的基因也可能被内切酶切断 BamHI BamHI BamHI BamHI BamHI Target gene 二、随机片断化 1. 限制性内切酶不完全消化法 （1）限制性内切酶的选用原则 1）内切酶识别位点的碱基数 4 bp 4 ：平均4 =256 bp一个切点 6 6 bp ：平均4 =4096 bp一个切点 HaeIII ：GG↓CC （常用）4 bp酶： AluI ：AG↓CT Sau3AI ：↓GATC 2）4 bp酶切的优点 随机程度高，不易遇到大片段内无切点的现象 易获得重叠片断 在部分酶切条件下能得到15～20 kb 片断 Sau3AI 部分酶切 2. 机械切割法 （1）超声波 超声波强烈作用 约300 bp的随机片段 （2）高速搅拌 1500 r/min下搅拌30 min 约8 kb的随机片段 第二节 化学合成目的基因 H.G. Khorana于1976年合成大肠杆菌酪氨酸抑制tRNA基因 一、常用的方法及其原理 磷酸二酯法 磷酸三酯法 亚磷酸三酯法 固相合成法 自动化合成法 Har Gobind Khorana 1922－2011 1. 磷酸二酯法 （1950s, Khorana ） 5′ （1）原理 3′ 保护5′—活化3′—连接—脱保护 l HO-P=O 1）保护dNTP的5′端 l 2）乙酸保护另一个dNTP的3′-OH 3 ）带保护的单核苷酸连接成磷酸二酯键 4）脱3′乙酸 缺点：磷酸上的侧位OH影响以后的反应