第五章基因组测序技术.ppt

第五章 基因组测序技术 一些主要模式生物基因组测序概况 1995年 7月，第一个基因组——流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）的全序列发 表，大小为1.8 Mb； 1996年 10月，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 的基因组全部测序完成； 1997年 9月，大肠杆菌（Escherichia coli）基因组全部测 序完成，全长5 Mb； 2001年 12月，线虫（Caenorhabditis ele gans）基因组测序完成. 一些主要模式生物基因组测序概况 2000年：3月，Celera公司完成果蝇（Drosophila me lanogaster）基因组（180 Mb）的全部测序工作，在当时所有已测序的基因组中是最大的 ，同时这也证明了“全基因组鸟枪法”的可行性； 2000年 12 月，第一个植物基因组——拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组被全部测序 ，大小为125 Mb. 一、测序流程 1.构建生物基因组文库或cDNA文库 DNA的提取和制备→酶切制备克隆用DNA片段 →与载体连接→转化受体细胞 →筛选鉴定→扩增培养。 2. 从基因组文库中提取DNA大片段，进行测序： 将DNA用超声波（或限制性内切酶）切成能够测序的小片断(200-500bp)→小片断和载体结合，植入细菌中进行扩增（或用PCR扩增） →从细菌中提取出繁殖好的质粒→ 酶切，制取测序的DNA片段 3. 测序：上测序仪测序 。 4. 利用重叠技术，排出DNA大片段的序列。 二、DNA测序的方法 双脱氧链终止法测序 化学降解法测序 自动化测序 非常规DNA测序 （一）Sanger的双脱氧链末端终止法 1.基本原理: 通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。 2.技术路线与要求 制备单链模板 ↓ 将单链模板与一小段引物退火 ↓ 加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸 分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓ 将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓ 根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列 （二）Maxam-Gilbert的化学降解法 1.基本原理 是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。 2 技术路线 将双链DNA样品变为单链 ↓ 每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带 ↓ 分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体 ↓ 电泳,读取DNA的核苷酸顺序 Maxam-Gilbert 法所用的化学技术 化学法测序实例 改进的特异化学切割反应 （三）自动化测序 1.基本原理 与链终止法测序原理相同,只是用不同的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红色荧光,ddCTP标记蓝色荧光, ddGTP标记黄色荧光, ddTTP标记绿色荧光.由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基. （四） 非常规测序 1. 毛细管电泳 用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳,节省时间,加快测序进程,其他程序同链终止法或化学测序法. 2. 光点测序 脱氧三磷酸核苷酸连接到DNA 3’-末端时会释放1个焦磷酸(PPi) ,焦磷酸在磷酸化酶的作用下转化为化学能,并发出光亮.由此,往反应液中每次只加入1种核苷酸,当加入的核苷酸结合时,反应液发出亮点,并记录核苷酸种类;当核苷酸未结合时,反应液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸,由此来测定DNA序列. 3. DNA芯片测序 基本原理 将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上, 每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置.待检测的DNA分子与芯片温浴,凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号,然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装,拼接成完全的DNA顺序. 三、测序及序列的组装的策略 （一） 随机测序与序列组装 随机测序也称”鸟枪法”. 实例:流感嗜血杆菌基因组的测序及顺序组装 超声波打断纯化的基因组DNA ↓ 琼脂糖电泳收集1.6～2.0Kb的区段、纯化