单分子检测与荧光相关光谱详解.ppt

在描述SMD所用的光学方法之前，有必要理解限制观察体积的原理，通常用到的方法是TIR，当一束光照遇到具有较低折射率的界面的远极面，并且入射角大于临界角是便会发生全内反射。 TIR的县官物理学原理是复杂的，但其最终的结构确实简单的。 * 很难制备这种含有单个荧光的纳米尺寸的结构的容器。共聚焦荧光显微技术解决了上述问题。 假设样品比单层荧光团厚，比如包含低浓度荧光团的单分子膜。 * 在单分子检测中，除去激发波长出的散射光的影响是非常必要的。精密的光学滤波器能很容易实现这一目的。 * 在单分子检测中，除去激发波长出的散射光的影响是非常必要的。精密的光学滤波器能很容易实现这一目的。 * * * 单分子荧光检测与荧光相关光谱 分子发光分析 分子发光分析 主要内容： 分子发光分析 概述 概 念： 单分子荧光检测是检测灵敏度达到分子水平的一系列高灵敏检测技术的总称。已经达到了分子检测灵敏度的极限。它能对单个分子进行检测和成像，而且可以通过对单分子的光谱性质进行测量，从而对化学反应的途径进行实时监测，能对生物大分子进行探测并提供分子结构与功能之间的信息。其检测的空间尺度能达到纳米数量级。 分子发光分析 概述 1.单分子检测的理论意义: 通常对大量分子集合体的观察测量只能反映分子的平均效应，这种平均效应掩盖了许多特殊的信息；而这些特殊的信息在研究具有非均匀特性的凝聚相物质和生物大分子结构式显得尤为重要。 体系中各个分子的变化过程与时间密切相关，单分子检测可以对体系中的单个分子进行研究；单分子的特征对局部场的存在非常敏感，可以反映局部微观环境的信息。可以得到在特殊时刻，特定分子的特殊位置和行为。 采用单分子效应可能观察到未知领域的新效应。如单分子体系的波动行为或不确定行为。 分子发光分析 概述 2.单分子荧光的产生原理： 荧光的产生原理可以用右图来描述：S0、S1、S2分别表示分子基态、第一和第二激发单重态。T1为激发三重态，分子吸收光子后，被激发到S1、S2较高的能级之后，迅速弛豫到S1的最低震动能级，然后发射一个荧光光子，同时使分子回到S0的较高激发态，并弛豫迅速到S0的最低震动能级。分子便处于新一轮的激发和发射循环。 分子发光分析 概述 根据荧光寿命和分子在激光束中停留时间,可算出单个分子发射的最大光子数为105~106。目前光学检测系统收集、检测光子的效率约为1%或0.5%~5%,故单个分子仍可被检测到数千光子信号。 检出限约为10-13mol/L 分子发光分析 概述 3.两个基本要求： 在被照射的体积中只有一个分子与光子发生相互作用，可以通过调整体系的浓度或密度来实现。 单分子的新号要大于背景的干扰信号，要减少拉曼散射、瑞利散射及其它杂质荧光造成的干扰。缩小探测体积能有效减少背景干扰。 分子发光分析 概述 4.单分子荧光的特征： 量子跳跃 发射－暗态交替的量子跳跃过程是单分子荧光的典型特征，取决于单分子的周围环境和猝灭途径，是实验中单分子荧光光谱和荧光强度涨落现象的原因。 荧光偏振 单分子荧光分子具有唯一的固有荧光和吸收跃迁偶极矩，分子只吸收偏正方向与其偶极矩方向一致的光子。因此在偏振激光的激发下，通过测量单个分子的吸收和荧光的偏振方向，可以确定单个荧光分子的空间取向。 分子发光分析 23.1单分子的可检测能力 影响分子检测能力的因素： 由于样品中杂质产生的背景干扰； 溶剂杂质荧光产生的背景干扰； 分子不同,荧光量子产率等光物理性质不同,导致发射的光子数不同； 提高分子检测能力的方法： 单分子信号与探测体积无关,而背景正比于探测体积，采用pL(皮升)、或fL（飞升）级探测体积； 结合光谱滤波和时间分辨等技术。 23.1单分子的可检测能力 分子发光分析 罗丹明6G是单分子检测常用的一种荧光染料，右图显示了罗丹明6G的发射光谱和溶剂乙二醇的拉曼光谱图。 相对于单个罗丹明6G分子的水的拉曼散射强度 分子发光分析 23.2全内反射和共聚焦光学系统 23.2.1全内反射（TIR） 分子发光分析 23.2全内反射和共聚焦光学系统 23.2.2共聚焦光学检测系统 通过物镜照明的方法叫落射照明； 入射光能激发照射锥里面所有的荧光团； 发射光通过物镜被回收，称为荧光配置； 散射光被双色向滤光镜分离出来； 双色向滤光镜是一种能透过一些波长的光，二反射其他波长的光的装置。 共聚焦光学检测原理 检测器 激发光 发射光 滤光镜 分子发光分析 23.3SMD光学装置 几乎所有的单分子荧光检测器都使用光学装置限制观察体积。在宽视场检测和逐点检测中用到了不同的方法。在宽视场检测中最常用的是全内反射，右图是两种常用的宽视场检测方法。两种方法都是基于倒置显微镜。 使用第一种方法是要使入射光瞄准物镜的焦点。 棱镜 物镜 滤光器 电感耦合摄像机 更直接 更方便