《兽医学》实验课分析.pptVIP

实验五 动物血清 转氨酶的测定 实验目的与要求 初步掌握血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）测定的实验条件、方法和步骤。 了解本次所测定血清酶的临床意义。 血清ALT的测定 血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）作用于丙氨酸及α-酮戊二酸组成的基质，产生丙酮酸及谷氨酸。 【原理】 血清ALT的测定 丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸2,4-二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，再与同样处理的丙酮酸标准液进行比色，计算出酶的单位。 血清ALT的测定 【试剂】 0.1mol/L磷酸氢二钠：磷酸氢二钠（含两个结晶水）17.6g溶解于水中，并加水1000ml，冰箱内保存。 0.1mol/L磷酸二氢钾溶液：磷酸二氢钾13.6g溶解于水中，加水至1000ml，冰箱内保存。 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）：将420ml0.1mol/L磷酸氢二钠溶液和80ml0.1mol/L磷酸二氢钾溶液混匀，置冰箱内保存。 血清ALT的测定 基质缓冲液（DL-丙氨酸200mmol/L，α-酮戊二酸2mmol/L）：精确称取1.79gDL-丙氨酸和29.2mgα-酮戊二酸，先溶于约50ml 0.1mol/L磷酸缓冲液中，用0.1mol/L氢氧化钠（约0.5ml）调节到pH7.4，再加磷酸缓冲液至100ml，置冰箱内保存，可稳定2周。基质中可加麝香草酚（每毫升基质加入0.9g）防腐。置冰箱内至少可保存1个月。分装安瓶灭菌后，室温至少可用3个月。 血清ALT的测定 1mmol/L2,4-二硝基苯肼溶液：称19.8mg2,4-二硝基苯肼，溶解于100ml1mol/L盐酸中，置是室温中保存。 0.4mol/L氢氧化钠溶液：将16.0g氢氧化钠溶解于水中，并加至100ml，置具塞塑料试剂瓶中，室温可长期保存。 2mmol/L丙酮酸标准溶液：准确称取22.0mg丙酮酸（AR），置于1000ml容量瓶中，加0.05mol/L硫酸至刻度。 血清ALT的测定 【操作方法】 在测定前，将基质在37℃水浴箱内预温5min使用。具体操作按表1-1进行。 管号 测定管 对照管 血清（ml） 0.1 0.1 基质溶液（ml） 0.5 — 表1-1 ALT测定操作步骤 血清ALT的测定 各管混匀后，在37℃水浴保温20min，然后每管加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml，室温放置10min，在505nm以蒸馏水校正零点，读取各管的吸光度。测定管吸光度减去对照管吸光度后，从标准曲线查得ALT活力单位。 2,4-二硝基苯肼溶液（ml） 0.5 0.5 基质溶液（ml） — 0.5 混匀后，在37℃水浴中保温30min。 血清ALT的测定 【标准曲线绘制】 按表1-2向各管中加入相应试剂。 管号 0 1 2 3 4 0.1mol/L磷酸缓冲液（ml） 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 2mmol/L丙酮酸标准液（ml） 0 0.05 0.10 0.15 0.20 基质缓冲液（ml） 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 相当于酶活力（卡门氏单位） 0 28 57 97 150 表1-2 ALT各标准管的配制 血清ALT的测定 各管加入2,4-二硝基苯肼溶液0.5ml，混匀，37℃ 20min后加入 0.4mol/L 氢氧化钠溶液 0.5ml。 混匀，放置10min后在505nm比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。各管吸光度减去“0”号管吸光度，所得差值与对应得卡门氏酶活力单位作图。 【临床意义】 很多脏器都含有ALT，其分布大致为肝＞肾＞心＞肌肉。肝内ALT活性远远超过其它脏器的活性，主要存在于肝细胞质的可溶性部分，测定ALT对反映肝脏损害具有特殊意义。 血清ALT活性增高原因：急性病毒性肝炎；骨骼肌、肾脏及胰腺等组织坏死；伴有急性肝炎的传染性单核细胞增多症；严重心肌梗塞、心力衰竭时的肝郁血；胆道疾病、肝外癌性胆道梗阻性黄疸、胆石症、胆管炎及胆囊炎；药物、酒精、铅、汞、四氯化碳等中毒；外科手术、麻醉、剧烈运动、早期妊娠等。 血清ALT的测定 血清ALT的测定 【注意事项】 溶血的血清可能会引起测定管吸光度增加，因此，检测此类标本时，应做血清标本对照管。 当血清的标本酶活性超过150卡门单位时，应将血清用生理盐水稀释后再进行测定。 血清ALT的测定 【注意事项】 加入2,4-二硝基苯肼溶液后，应充分反应混匀，使反应完全，加氢氧化钠溶液方法要一致，不同方法会导致吸光度读数的差异。 基质中的α-酮戊二酸和2,4-二硝基苯肼均为呈色物质，称量必须准确，每批试剂的空白管吸光度上下波动不用超过0.015，如超出此范围应检查试剂及仪器方面等问题。 血清AST的测定