基因克隆表达-final-ZJJ.ppt

一、概述 确定了遗传信息的携带者 揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理 提出了中心法则和操纵子学说，破译了遗传密码 通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。 二、克隆载体 复制基因(replicator) 选择性记号 克隆位点 样品的要求 目标基因序列（最好附原始测序报告）； 克隆模板（包括：菌液、质粒、PCR扩增产物、RT-PCR扩增产物、从其他质粒上酶切得到的DNA片段等）及检测结果和背景资料； 载体及其图谱（常用载体可由我方免费提供）； 注明克隆要求，克隆使用的酶切位点。 服务流程 载体构建流程为：酶切、凝胶回收、连接、转化、鉴定、测序。 完成时间 2周内完成。 最终产品 构建好的重组质粒，不少于1μg； 含有重组质粒的菌株； 电泳图谱，测序图谱，酶切图。 技术背景 RACE的基本概念 不同厂家RACE试剂盒的介绍 RACE技术的关键环节 存在的问题及解决办法 最终产品的要求 技 术 背 景 得到某基因的片段、全长或近全长cDNA的方法： 建立和筛选cDNA 和DNA 文库。 利用GenBank 数据库中的表达序列标签(express sequence tags , ESTs) 拼接出全长或近全长cDNA 。 是多聚酶链式反应即PCR。 cDNA 末端快速扩增(RACE) 技术。 RACE的优点 此方法是通过PCR实现的，无需建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息； 节约了实验所花费的经费和时间； 只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长； RACE的基本概念 cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法，为Frohman在1985年首次报道。 3’RACE 和5’RACE 基本原理和方法 利用Oligo (dT) 对mRNA 进行反转录的同时在两头加上通用接头(引物) ，从而可利用基因特异的引物(gene specific primer，GSP)通过PCR 反应快速获得目的序列的5′端和3′端。 3’RACE原理示意图 RACE 产物的鉴定和全长 cDNA 的获得 不同厂家RACE试剂盒的介绍 clontech SMART RACE Invitrogen GeneRacerTM Kit BD SMARTTM RACE (Switching Mechanism At 5 end of the RNA Transcript ) RACE技术的关键环节 RACE 技术的关键环节有2个： 1. 3个连续的酶促反应 （逆转录、TdT加尾、PCR扩增） TdT加尾反应是用脱氧核糖核酸末端转移酶（TDT）催化，它可将dT依次加在寡核苷酸的3’端 2. RACE的引物 即使3个酶促反应均平稳顺利进行，但结果也通常会出现一些非特异性产物或非全长的产物背景。 存在的问题及解决办法 反转录 RNA的质量 有高质量的不被核糖核酸酶降解的RNA，RNA的完整性至关重要。一旦RNA降解就要重新提取，免得后期工作没有结果既浪费时间又浪费试剂，给试验带来麻烦。 反转录提前终止 模板中有特殊的二级结构，反转录提前终止。通过提高反转录的温度，加大反转录的反应体系以及反转录过程中一直保持已变性的RNA模板处于50℃以上，避免以解开二级结构的RNA再恢复原来的结构，以达到5’末端。 RACE引物的设计 在实验过程中总结如下经验： 引物不能设计在保守区简并引物区。 各引物之间尽量不要重叠，由于引物的重叠，会引起很严重的引物多联体现象，不能准确地扩增。 尽量多设计引物，以减少PCR扩增的非特异性。也可以考虑在PCR鉴定阳性克隆的时候另设计一对引物，便于鉴定的正确性。 PCR扩增及产物的克隆 PCR扩增存在的问题 一方面可能未找到最佳扩增条件而导致产生许多不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物； 另一方面，可能根本就没有扩增到任何产物。 增加PCR扩增效率，提高扩增产物的特异性解决方法： 热启动PCR(hotstartPCR)，长距离PCR(long distance PCR)和降落PCR(touch－down PCR)以及加大反应体系中Mg2+的浓度提高扩增效率。 单引物的线性扩增问题：坚持做单引物对照，并减少引物的浓度。 完成时间 完成时间3-6周内完成。对于有些RNA难以抽提的材料或样品材料本身质量问题，时间较长，会在1周内和客户协商约定时间。 特殊样品除外。 最终