ABI与Illumina测序仪比较教程.doc

ABI与Illumina、454测序仪比较 Illumina 测序仪 Illumina公司的新一代测序仪Genome Analyzer最早由Solexa公司研发，利用其专利核心技术“DNA簇”和“可逆性末端终结（reversible terminator）”，实现自动化样本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。Illumina公司于2007年花费6亿美金的巨资收购了Solexa，就是为了促成Genome Analyzer的商品化。Genome Analyzer作为新一代测序技术平台，具有高准确性，高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优势，可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学 （基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。 Genome Analyzer自上市以来，已经为千人基因组计划立下了赫赫战功。今年早期，荷兰科学家利用它首次绘出女性的基因组图谱。而就在前两周，《Nature》杂志上一连出现三个人类基因组图谱：炎黄一号-第一个亚洲人图谱；第一个癌症病人图谱；第一个非洲人图谱。它们全是依赖Genome Analyzer完成的。哗，一下就来仨！这和第一个人类基因组图谱的13年形成了多么鲜明的对照。 ?根据去年底的数据，Genome Analyzer已售出约200台，估计是市场占有率最广的。前不久，华大基因再添置了12台，准备放在香港和深圳的实验室，至此华大基因已经有29台Genome Analyzer。而著名的麻省理工学院和哈佛大学Broad研究院拥有47台Illumina测序仪。众多实验室之所以选择Illumina，看中的无疑是Genome Analyzer的高性价比。 上个月，Illumina将Genome Analyzer II升级到Genome Analyzer IIx，距年底实现单次运行获得95 GB数据的宏伟目标又近了一步。Genome Analyzer IIx有两个核心特征：其一是更大的试剂冷却器，支持超过100个测序循环，进一步提升了系统的易用性和自动化；其二是全新的流动池支架，让每轮运行所得的高质量数据增加20%。依靠系统软件和试剂的改进，Genome Analyzer IIx现在能够支持100 bp以上的配对末端读长，并在每次运行中产生超过20 GB的高质量数据。 Genome Analyzer技术的基本原理： 1. 文库制备将基因组DNA打成几百个碱基（或更短）的小片段，在片段的两个末端加上接头(adapter)。 2. 产生DNA簇利用专利的芯片，其表面连接有一层单链引物，DNA片段变成单链后通过与芯片表面的引物碱基互补被一端“固定”在芯片上。另外一端（5’或3’）随机和附近的另外一个引物互补，也被“固定”住，形成“桥 (bridge) “。反复30轮扩增，每个单分子得到了1000倍扩增，成为单克隆DNA簇。DNA簇产生之后，扩增子被线性化，测序引物随后杂交在目标区域一侧的通用序列上。 3. 测序Genome Analyzer系统应用了边合成边测序（Sequencing By Synthesis）的原理。加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。 这些核苷酸是“可逆终止子”，因为3’羟基末端带有可化学切割的部分，它只容许每个循环掺入单个碱基。此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。之后，将这些基团化学切割，恢复3端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA片段的序列。目前的配对末端读长可达到2×50 bp，更长的读长也能实现，但错误率会增高。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。 4. 数据分析自动读取碱基，数据被转移到自动分析通道进行二次分析。 Genome Analyzer系统之所以如此畅销，关键在于其技术上的优势。 1. 可扩展的超高通量Genome Analyzer系统目前每次运行后可获得超过20 GB的高品质过滤数据。这个技术的可扩展性保证了更高的数据密度和输出，能用更少的经费完成更复杂的项目。到今年底，通量还有望上升到95 GB，相当于人类基因组的30倍覆盖度。 2. 需要样品量少Genome Analyzer系统需要的样品量低至100ng，能应用在很多样品有限的实验（比如免疫沉淀、显微切割等）中。这也是很多研究人员所考虑的因素。 3. 简单、快速、自动化Genome Analyzer系统提供了最简单和简洁的工作流程。即使是最小的实验室也能像大型基因组中心一样进行大规模的实验。制备样品文库可以在几小时内完成，一个星期内就能得到高精确度的数据。Cluster Station可以说是