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第四章 动物细胞培养反应器 动物细胞培养的产物 大规模的动物细胞培养开始于上世纪60年代，经过多年来的研究，人类对动物细胞培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大的进展。尽管如此，目前的技术水平还远不能满足细胞生物产品研究和生产的要求，随着动物细胞培养技术的应用日趋广泛，已显示出很广阔的发展前景。 利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50%。 大量资料表明，生物技术药物是当前新药开发的重要领域，生物技术制药工业是下一个10年制药工业的重要新门类，期间将有数百种生物技术新药上市。目前,动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率与保证其质量上。 微生物和动物细胞培养方法的比较 体外培养的动物细胞有两种类型 一种是非贴壁依赖型细胞，来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些转化细胞属于这一类型，可采用类似微生物培养的方法进行悬浮培养。 另一种是贴壁依赖型细胞，大多数动物细胞，包括非淋巴组织的细胞和许多异倍体细胞属于这一类型，他们需要附着于带适量正电荷的固体或半固体表面上生长。 大多数动物细胞属于贴壁依赖型细胞 常用的细胞系 Hela：美国妇女宫颈癌细胞 Vero：非洲绿猴肾细胞 BHK：仓鼠肾细胞 CHO：中国仓鼠卵巢细胞 细胞贴壁过程 接触抑制(contact inhibition) 培养器皿 二、悬浮培养 所谓悬浮培养，是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程。主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交瘤细胞等。 动物细胞的悬浮培养是在微生物发酵的基础上发展起来的。由于动物细胞的特点（如：没有细胞壁保护，不能耐受剧烈的搅拌和通气），因此在许多方面又与经典的发酵不同。 悬浮培养的细胞密度较低，转化细胞悬浮培养有潜在的致癌危险，培养病毒易失去病毒标记而降低免疫能力。 流加操作的特点就是能够调节培养环境中营养物质的浓度。一方面，它可以避免某种营养成分的初始浓度过高而出现底物抑制现象。另外一个方面，能防止某些限制性营养成分在培养过程中被消耗而影响细胞的生长和产物的形成，这是流加式操作与分批式操作的明显不同。此外，由于新鲜培养液的加入，整个过程中反应体积是变化的，这也是它的一个重要特征。 最常见的流加物质是葡萄糖、谷氨酰胺等能源和碳源物质。 五、灌注式操作培养 灌注式操作是指细胞接种后进行培养，一方面新鲜培养基不断加入反应器，另一方面又将反应液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。 细胞灌注培养系统实例 5个不同阶段（动物细胞培养由实验室建立的细胞株到反应器的大规模培养） 第一阶段，筛选和开发能表达所需产物的细胞系。 第二阶段，在方瓶和转瓶中确定该细胞系对营养物质和环境的要求。 第三阶段，细胞培养转入生物反应器中进行，最理想的是采用由生产规模的反应器缩小的台式反应器。 第四阶段，在中试规模进一步根据生产的实际条件和可能性，确定过程的控制方案，根据细胞株的实际情况寻求过程的优化方案，对培养的环境作进一步的调整。 第五阶段，扩大到生产规模。 细胞培养放大过程的5个主要阶段 一、培养基组成 血清的作用在于向细胞提供激素（生化因子）、转移蛋白和其他营养物质。目前血清是培养基中不可缺少的组分，并成为达到最优化和经济性目标的障碍。降低血清用量和采用无血清培养基成为研究的热点。 血清培养基的考虑 1、血清中含有广泛的微量组分，对细胞生长有相当大的作用，但对其存在的作用至今还未充分确定。 2、对通过细胞培养获得产物的过程，血清的存在是纯化的主要障碍，甚至难以使产物形成医药产品。 3、血清常受病毒污染，其中许多对细胞培养无害，但增加了未知因素，未操作者不能控制。 4、血清是培养基成本的主要部分 5、血清不仅有生长促进活力，而且有生长抑制活力。 6、实验和生产过程的标准化困难。 二、限制细胞生长的因素 在动物细胞培养系统中有许多因素限制了细胞生长。与微生物发酵相比，动物细胞培养能达到的细胞密度比较低。根据不同的细胞类型、培养系统和培养基组成，其范围为每毫升（0.5-5）×106个细胞。 三、污染的控制 动物细胞培养物可能被各种微生物病毒污染。这些污染物的来源包括细胞种子、血清、试剂、实验室环境和操作人员。 在生产过程或实验室空间中，完全没有微生物的污染是不可能的，这需要通过改进设备的设计消除这些污染源，其中反应器的设计是关键。实验人员也常是重要的污染源，无菌操作技术的良好训练是污染控制的基础。 四、产物表达的控制 动物细胞培养的产物有两大类。一是细胞本身，另一是由细胞分泌的某些产