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荧光光谱仪 主要内容 荧光光谱仪的工作原理 荧光光谱仪的结构 荧光产生的基本原理 荧光：某些物质吸收光能量后，可发射波长与激发光波长相同或不同的光，当激发光源停止照射试样，再发射过程立即停止，这种再发射的光称为荧光（fluorescence）。 荧光分析法：通过测定物质分子产生的荧光强度进行物质的定性与定量分析的方法。 荧光光谱法特点 灵敏度高； 用量少； 选择好； 应用范围不如吸收光谱法广； 对温度、pH值等因素变化比较敏感； 荧光分析的基本原理 1.荧光的激发光谱：固定测量波长（选最大荧光/发射波长），化合物发射的荧光(或磷光)强度与照射光波长的关系曲线。 2.荧光光谱 ：固定激发光波长（选最大激发/吸收波长）， 化合物发射的荧光(或磷光)强度与发射光波长关系曲线。 3. 最大激发波长(λex)和最大荧光波长(λem) λex λem 菲 物质分子结构与荧光的关系 具有共轭双键体系的分子 化合物（环己烷中） 结 构 荧光效率 荧光波长（nm） 苯 0.07 283 联苯 0.18 316 对-联三苯 0.93 342 物质分子结构与荧光的关系 ②具有刚性平面结构 物质分子结构与荧光的关系 ③具有最低的单线电子激发态S1为π- π型。 ④若取代基团为给电子取代基，荧光强度增加 荧光光谱仪的工作原理 对于某一荧光物质的稀溶液，在激发光的频率、强度以及液层厚度不变时，此荧光物质所发出的荧光强度与溶液的浓度成正比。由此可以通过测定荧光强度来求出该物质的含量。 荧光分析法所测量的是待测物质所发射的荧光强弱，它属于发散光谱。 荧光光谱仪的分类 荧光光谱仪 荧光光度计 荧光分光光度计 区别：单色器色散元件的不同 Fluoscence荧光分光光度计 FP-6500荧光分光光度计 荧光光谱仪结构 激发光源 单色器 样品池 检测器 记录显示系统 0.208 光源 激发单色器 吸收池 检测放大系统 发射单色器 荧光光谱仪结构 荧光分光光度计光路图 仪器的使用与维护 注意事项 电源：触发电压、工作电流、稳定性 光源：启动预热、冷却重启、保持清洁 单色器：防潮、防尘、防污和防机械损伤 光电倍增管：避免高压时受到外来光线直射 样品池：清洗、插放方向、避免摩擦 个人防护 ： 避免紫外线损伤 荧光光谱仪的应用 常规分析（如定性和定量分析、化学表征、色谱流出物的检测等）； 获得分子信息（如测量分子内间距、决定键合平衡、研究结构变化等）； 医药研究（如研究膜结构和功能、确定抗体的形态、研究生物分子的异质性、评价药物的相互作用、确定酶的活性和反应、荧光免疫分析、监测体内化学过程等）； 环境监测（如水和空气中污染物的鉴别和计量等）。 * 荧光的发生和强度与物质的分子结构有着密切的关系。具体来讲，由于物质的结构不同，所吸收光的波长和发射的荧光波长也不相同，利用这个特性可以定性鉴别物质。对于同种物质，用同一种波长的激发光照射可以发射相同波长的荧光。若是物质的浓度不同，则浓度大时，所发射的荧光强度亦强，利用这个性质可以进行定量分析。 * 比紫外可见分光光度计法高2-3个数量级，检测限最低可达10-14M。基于这些优点，荧光分析法被用在了高效液相色谱和毛细管电泳的高灵敏度的检测器。能吸收光的物质不一定都能产生荧光，吸收同一波长的光，所产生的荧光波长也不尽相同。所以只要控制好激发光和荧光单色器的波长，就可以得到选择性良好的测定方法。 * 激发光谱的绘制方法：将激发光的光源用单色器分光，测定不同波长的激发光照射下，荧光最强的波长处荧光强度的变化，以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，就可以得到荧光物质的激发波长。 为什么选择激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大； 荧光光谱的绘制方法：固定激发光波长和强度，而让物质发射的荧光通过单色器进行分光，以测定不同波长处的荧光强度。以荧光波长作横坐标，荧光强度为纵坐标，得到荧光光谱。 何谓光谱？ * 这里要注意的是：发射光谱的形状与激发波长无关。也就是说对于某种分子而言，无论用多大波长的光波激发，荧光光谱的形状、位置都是不变的，在不同波长的光线照射下，化合物发射的荧光(磷光)强度与发射光波长关系曲线的趋势是一定的。 但是激发波长不相同时，荧光物质发射的荧光强度会不同，处于最大激发波长时激发态的分子最多，荧光强度最大； 如果把某一荧光物质的荧光光谱和激发光谱的形状做一个比较后， 我们会发现，通常荧光光谱尤其是荧光光谱中第一吸收带所对应的曲线和激发光谱呈现大致的镜像对称。为什么呢？ 因为吸收光谱中的第一吸收带是物质分子由基态激发至第一激发态各个振动能级所致，其形状决定于第一激发态振动能级的分布情况；而荧光光谱是受激发的分子从第一激发态的最低振动能级返回到基态中的各振动能级所致，其形状取决于基