肺炎链球菌的检测与分型技术分析报告.pptVIP

关于肺炎链球菌的MLST 研究最早出现在1998 年。目前已经肺炎链球菌的mlst型别将近9000个。 通过对比菌株血清型与mlst型别发现，大多数mlst型别相同的菌株表现为相同血清型，但这并不代表某一mslt型别的菌株肯定为特定血清型或mlst方法可以完全取代血清分型。 Mlst分型也是研究肺炎链球菌菌株致病能力与耐药情况的有力工具。 研究人员通过比较全球范围内致病菌株与其耐药性的关系，已经鉴定出43个高致病克隆群 这说明：国际上的高致病菌株已经传入我国 另一方面由于肺炎球菌分布的地区差异性较大，我国的菌株存在自身的特征；而由于国内这方面工作开展较慢，国外的数据库尚缺乏中国的数据 * 脉冲场凝胶电泳技术是80年代初期发展起来的，在美国被广泛的应用于食源性病原的监测工作。脉冲场凝胶电泳技术通过电泳条带的变化以宏观的形式反映了细菌基因组水平上微观的变化。 PFGE是基于DNA指纹技术而建立起来的分型方法，对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义 PFGE 以其重复性好, 分辨力强而被誉为细菌 分子生物学分型技术的“ 金标准”。它可以用于大 分子DNA 的分离, 其分辨范围达到10 Mb。而普 通的琼脂糖凝胶电泳仅能分离小于50 0 kb 的 DNA 分子。PFGE 的基本原理是：细菌基因组上存在很多酶切位点，这些位点是可以随细菌稳定遗传的。当选用适当的内切酶对细菌进行酶切处理后，特征不同的细菌断裂位置不同，通过电场的不断 改变, 使包埋在琼脂糖凝胶中的DNA 分子的泳动 方向做相应改变, 小的DNA 分子比大的变化快,故小分子泳动的快, 从而在凝胶上按染色体大小 而呈现出电泳带型。 中国疾控中心传染病所基于pfge技术已经建立了全国范围的细菌性病原监测网络，而肺炎链球菌的病原监测也是这个网络的重要组成部分。目前我们已经制定了标准化的肺炎链球菌的pfge操作规范，相关文章已经发表 Mlva也就是我们常说的多位点数目可变串联重复序列分析，是建立在数目可变的串联重复序列技术之上的一种分型方法，主要检测小卫星DNA或微卫星DNA的序列变化。 这些序列一般位于基因侧翼或内含子等非编码区，在整个基因组上存在于多个位点，其序列主要有多个相同的重复单元构成，且相同菌株具有稳定遗传的特征，表现为相同菌株相同位点上的序列重复数目相同，而不同菌株表现为串联重复单位的数目不同。 MLVA操作非常简单，首先针对不同的位点设计相应的引物，对所选的串联重复位点进 行PCR扩增，以琼脂糖凝胶电泳确定PCR产物的大 小，然后根据不同串联重复的长度得出每个位点的重 复数目，结果以数字表示。这样每个菌株的分型结果就演变为了一组数字化的组合数据，便于在不同实验室间进行相互比较。 另外采用荧光标记技术实现了高通量自动化检测。 由于mlva进化较为保守，因此，适用于病原的长时间追踪研 究，在鉴别内源性复发和外源性感染方面具有优势 目前国际上有2个影响力较高的肺炎链球菌MLVA数据库。其中一个是有英国和法国联合设置的（左侧），采用17个位点进行分析，目前已经收录了1087个型。 另外一个是由荷兰卫生部和国力公共卫生研究所联合建立的，采用8个位点作为分型标准，目前已经收录了1399个基因型。 这2个数据库的最大区别在于进行mlva分析时，选取的分析位点数目不同。理论上来说，选取的位点数目越多，其分辨率也越高；于此同时，其费用也就越高，分型结果解释也较为困难。因此在实际操作中，我们应根据实验目的和操作条件采用适宜的位点进行分析。如果我们研究的菌株来源于较短的时间间隔或较小空间范围，最好选择位点较多MLVA，反之选择位点较少的MLVA 后三种方法不可用作鉴定肺炎链球菌 * 基于分子特征 肺炎链球菌分型技术-脉冲场分型 PFGE Typing SOP 《我国部分地区肺炎链球菌血清分型与脉冲场凝胶电泳分型分析 》：《中国疫苗和免疫》2010年第03期 基于分子特征 MLVA：Multiple-Locus variable number tandem repeat Analysis 细菌基因组中广泛分布的短重复序列（repetitive sequence），它们在菌株、种、属水平上分布有差异及进化过程有相对保守性。 VNTR-PCR：即细菌基因组重复序列PCR技术；是扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列，通过电泳条带比较分析，揭示基因组间的差异。 基于分子特征 基于分子特征 方法 原理/靶位点 优势 缺点 PFGE 全基因限制性多态性 相对较高的分辨率 适用于爆发流行研究 需要特殊技术 速度慢 得到的是条带信息 实验室间比对受限 易受其他因素影响 MLST 测序确定管家基因等位变异 可进行菌株种系分析 序列信息 可