白色念珠菌菌液制备.docVIP

白色念珠菌菌液制备：接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24～28小时；取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml ，采用10倍递增稀释法稀释至10-6～10-7，制成每1ml含菌数50～100cfu 的孢子悬浮液。 黑曲菌菌液制备：接种黑曲菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中， 23～28℃培养5～7天，加入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸至无菌试管中，取1ml加无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4～10-6，制成每1ml含菌数50～100cfu的孢子悬液。 供试液的制备 无抑菌活性的供试品供试液的制备 稀释剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 液体供试品：供试品10ml置锥形瓶中，加90ml稀释剂，混匀，作为供试液（1：10） 固体、半固体、粘稠性供试品：称取供试品10g置锥形瓶中，加稀释剂至 100ml，混匀后，作为供试液（1：10）。 具有抑菌活性的供试品试液的制备 当供试品具有抑菌活性时，须先消除抑菌活性，其方法如下： 培养基稀释法：取供试液2ml，每0.2ml的供试液注一皿或每0.1ml的供试液 注一皿；或取供试液1ml每0.5ml的供试液注一皿，倾注15ml的培养基，测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数，混匀，凝固，培养。每1ml供试液所注的平皿生长的菌数之和即为1ml的菌落数。计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法技术规则报告菌数。控制菌检查时可加大增菌液的用量。 离心沉淀集菌法：取一定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有 沉淀，先以500转/分离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约 2ml，加稀释液补至原量。 薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释剂供试液，过滤，冲洗吗，按薄膜过滤法测定其菌落数。 中和法：选取适宜的中和剂消除供试品的抑菌活性后测定。 菌液组：测定所加的试验菌数。 采用平皿法， 取试验用的 1ml 菌液 （约 50 ～ 100cfu ） 分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备 2 个平皿，按平皿法测定其菌 落数。 ? 1.5?? 试验组 ? 平皿法： 取试验可能用的最低稀释级 1ml 供试液和 50 ～ 100cfu 试验菌， 分别注 入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备 2 个平皿，按平皿法测定其菌落数。 ? 1.5.2 培养基稀释法 （平皿法） ： 取试验可能用的最低稀释级 1ml 供试液分别注入 N 个平 皿中，每个平皿再注入 50 ～ 100cfu 试验菌，分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株 试验菌平均制备 2 个平皿，按平皿法测定其菌落数。 ? 1.5.3?? 薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低级供试液，过滤，冲洗，在最后一次 的冲洗液中加入 50 ～ 100cfu 试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌落数。至少要一张 膜。 ? 1.5.4?? 离心沉淀集菌法：取规定量试验可能用的最低稀释剂供试液，如供试液含许多 药渣，先以 500 转 / 分钟离心 3 ～ 5 分钟，取全部上清液，再以 3000 转 / 分离心 20 分钟， 取下面 1ml 液体， 并用稀释剂洗地管底， 将洗涤液与 1ml 液体一起采用平皿法或薄膜过 滤法计数。 ? 1.6?? 供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数（方法和试验组相同） 稀释剂对照组 若供试剂需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤法额、等处理时，应增加稀释剂对照 组。 用稀释剂代替供试品， 加入试验菌。 最终浓度为每 1ml 供试液含 50 ～ 100cfu ， 按试 验组的供试液制备方法和技术方法计算。 回收率计算 试验组回收率计算 试验组的菌回收率=菌液组的平均菌落数数供试品对照组平均菌落验组的菌回收率(100%? 稀释剂对照组回收率计算 ? ? 试验组的菌回收率 = 菌液组的平均菌落数 数 稀释剂对照组平均菌落 × 100%? 计数方法验证至少应进行 3 次独立平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 ? 1.9.? 在 3 次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落 数减去供试品对照组的平均菌落数占菌液组的品均菌落数的百分率）≥ 70% ，应采用自 然沉降法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这 些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证，是试验组菌回收率大于 70% 控制菌检验方法与验证 当建立药品的微生物限度检查时， 应进行控制菌检查方法的验证， 以确认所采用的方法 适合于该药品的控制菌检查方法测定。 若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检 验结果时，检验方法应进行重新验证。验证试验也可与供试品的控制菌检查同时