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第六章 蔬菜露地土壤氨氧化细菌(Ammonia-Oxidizing Bacteria)多样性分析 6.1 材料(同5.1) 6.2 土壤微生物总DNA的提取和纯化（同第二章方法二） 6.3 土壤氨氧化细菌的amoA基因PCR扩增反应，克隆和测序分析 PCR扩增所用引物： 引物1（amoA-1F）：5’- GGGGTTTCTACTGGTGGT -3’ 引物2（amoA-2R）：5’- CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC -3’ 具体的步骤及方法为： （1）DNA模板预处理 通过预试验证明当DNA模板稀释成50-100倍时，所得到的PCR扩增结果最理想。 因此将纯化处理的DNA稀释成50倍和100倍进行PCR扩增反应。 （2）每管PCR体系 ：50 μl 体系 Buffer 10× 5.0μl DNTP (10mM) 1.0 μl 引物1 (10 PM) 0.5 μl 引物2 (10 PM) 0.5 μl Taqase (5 U) 0.5 μl DNA模板 5 μl（100倍） 合计 12.5 μl （3）每管加dd H2O μl 37.5μl离心 A. 加石蜡油： 10 μl； B. 设置阳性对照，阴性对照，重复3次； （4）PCR ：采用降落PCR的运行程序 95℃ 5 min； 94℃ 45 s 60℃ 1 min 35 cycles 72℃ 1 min 72℃ 15 min； 4℃ 10 h （5）检测：1.0％ 琼脂糖电泳 （6）将片段的回收： A.将单一的目的条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中，称取重量。 B.向胶块中加入3倍体积的溶胶液，55℃水浴10 min，其间不断的上下翻转离心管，以确保胶块充分的溶解。 C.将上一步所得到的溶液加入到一个新的吸附柱中，13,000 rpm离心30 s，倒掉废液。将离心柱放回到收集管中。 D.向吸附柱中加入700 μl 漂洗液，13,000 rpm离心30 s, 倒掉废液。将离心柱放回到收集管中。 E.向吸附柱中加入500 μl 漂洗液，13,000 rpm离心30 s, 倒掉废液。将离心柱放回到收集管中。13,000 rpm离心2 min，尽量去除漂洗液。将吸附柱放置于 室温或是50℃温箱数分钟，彻底的凉干。 F.将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液30-50 μl（洗脱液65-70℃预热），室温放置2 min。13,000 rpm离心1 min收集DNA溶液。取5 μl 用于连接，其余-20℃ 保存。 （7）与pGEM-T载体连接，16℃连接过夜。10 μl体系如下： pGEM-T 1 μl T4 DNA连接酶（4U/ μl） 1 μl Buffer 2× 5 μl PCR 产物 3 μl 合计 10 μl （8）转化： A. 将连接产物加入到 TOP10高效感受态细胞中，感受态细胞（100 μl）置于冰上熔化用冷却的无菌吸头将上述细胞悬浮液分装到新的预冷的离心管，50μl／管加入连接反应液5.0 μl，轻轻旋转一混匀内容物，冰浴中放置30 min，每隔10 min轻轻旋转一下； B. 将管放置在42℃水浴中放置60-90 s，不要摇动快速的将管转移到冰浴中，使细胞冷却2－3 min每管化500 μl LB培养基，置于37℃摇床振荡培养，温浴45 min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素标记基因； C. 取100 μl的已经转化的感受态细胞转移到含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，用一无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，于37 ℃培养16 h，筛选阳性克隆（白色），用于摇菌和菌落PCR扩增鉴定。 （9）按下面组分加入到离心管中，根据载体引物进行PCR检测： T7: 5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′ SP6:5′-ACGATTTAGGTGACACTATAG-3′ 超纯水 8 μl 菌液 1 μl T7(10μmol/L) 0.5 μl SP6 (10μmol/L) 0.5 μl 2×Taq PCR Master Mix 10 μl 总体积