实验九水中总大肠菌群的测定教案解析.ppt

实验九 水中总大肠菌群的测定 一 实验器材 1 培养基 乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管）培养基、伊红美兰琼脂平板 2 溶液和试剂 革兰氏染色液 3 仪器和其他用品 高压湿热灭菌器、显微镜、载玻片、灭菌培养皿、灭菌吸管、试管、三角瓶、接种环 二 目的要求 1 学习检测水中总大肠菌群的方法。 2 了解检测水中总大肠菌群各种方法的原理及其应用中的优、缺点。 3 了解水质评价的微生物学卫生标准，明白其应用的重要性。 实验八 水中总大肠菌群的测定 三 基本原理 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。 多管发酵法的原理是根据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数简称MPN表示。食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数（most probable number, MPN)表示。 四 培养基的配制 （1）乳糖蛋白胨培养液：按照说明称取适量培养基，溶于蒸馏水中，分装于试管中，每个试管10ml，倒置一德汉氏小管，于115℃高压灭菌器中灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 （2） 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：按上述制备方法配制，除蒸馏水外，培养基用量增加至三倍，分装于试管中，每个试管5ml 。 （3） 伊红美培养基：按照说明称取适量培养基，置于三角瓶中，加蒸馏水溶解， 115℃高压灭菌15min，待冷却至45℃—50℃ ，倒平板待用。 培养基配制操作图示： 用漏斗分装培养基及摆斜面 培养基的分装：一般制作斜面培养基时，每只15×150毫米的试管，约装3～4毫升（1/4～1/3试管高度），如制作深层培养基，每只20×220毫米的试管约装12～15毫升。每只锥形瓶装入的培养基，一般以其容积的一半为宜。 ◆包扎 1．培养皿：以旧报纸密密包紧，一般以6套做一包，待灭菌。 2．吸管：在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段1.5cm长的棉花。棉花要塞得松紧恰当（过紧，吹吸液体太费劲；过松，吹气时棉花会下滑），然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的的近左端，与报纸约呈60o角，并将右端多余的报纸打一小结。 3．三角玻扒：跟包扎吸管相似，将三角部分斜放在报纸条的近左端，与报纸约呈45o角，并将右端多余的报纸打一小结。 4. 玻璃器皿、金属器械包扎完毕后置干燥箱160－170℃灭菌2 h. 1.灭菌器内加入一定量的水，将用防水纸包扎好的物品放入其中。 2.接通电源，进行加热。 3. 排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到0时再关闭排气阀。 4.当压力达15bl/in2（即1.05kg/cm2）时，此时灭菌器内的温度为1210C，维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。 5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。 ◆灭菌 高压蒸汽自动灭菌锅 手提式高压蒸汽灭菌锅 倒平板操作法示意图 斜面摆放与冷凝 五 操作步骤 1 水样的采取 （1）检测自来水 先将自来水龙头用火焰烧灼3 min灭菌，再开放水龙头使水流5 min后，在火焰旁打开灭菌三角瓶塞，以其接取水样，迅速地进行分析。 （2）检测池水、河水或湖水 应取距水面10－15cm的深层水样，先将灭菌带玻璃塞的空瓶瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，拨开玻璃塞，水即流入瓶中，满后将玻璃塞塞好，再从水中取出。有时需用特制的采样器取水样。采取的水样最好立即检测，否则需放入冰箱中保存。 3 初发酵试验 （1）生活饮用水 在两个装有已灭菌的50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中（内有倒管），以无菌操作各加入已充分混匀的水样100mL。在10支装有已灭