第8章克隆载体解读.pptVIP

第八章 克隆载体 第一节 质粒载体 第二节 噬菌体载体 第三节 Cosmids, YACs 和 BACs 第四节 用于真核生物的载体 载体是用于携带靶基因或靶 DNA 片段进入受体细胞 (宿主细胞)且能自主复制的小DNA分子. 载体的主要来源包括：质粒、病毒和人工载体. 不同类型载体可接受外来DNA的大小(容量)有所不同 能作为载体的基本条件（要求）包括； ? 高复制率； ? 一至多个限制酶切位点（每种酶一个切点）； ? 选择性标记（双标记）； ? 在靶DNA嵌入位点附近有高效启动子： 单一启动子只能转录插入DNA的一条链 ； 双启动子能转录其间的两条DNA链. 第一节 质粒载体 质粒主要作为以细菌为宿主的载体, 因其易分离和操作而得到广泛应用. 质粒载体的DNA容量相对较小,只有几个kb. 质粒载体经酶切、重组和转化后, 可通过质粒上的抗性标记筛选转化子, 但转化子有可能含有靶DNA或不含靶DNA(质粒没被酶切或切开后自连接). 不含靶DNA的质粒和含靶DNA的重组体质粒可通过酶切电泳图谱、双抗标记筛选和蓝白斑筛选加以区分。 1. λ噬菌体载体 λ噬菌体DNA的大小为48.5 kb, 是线性双链DNA 分子, 两端是12 bp cos端(位于一个16 bp特殊内 内切酶位点内). 在细胞内, λ噬菌体DNA能通过cos 末端互补配对形成环状分子，独立复制; λ噬菌体DNA也能通过cos端插入宿主基因组DNA中, 成为前噬菌体或称原噬菌体(溶原性反应). λ噬菌体DNA分子上约有20 kb的DNA序列能够被 外源DNA取代而不影响其感染和复制. 限制性内切酶BamH1能够切割λ噬菌体DNA, 使经同样酶切的靶DNA片段(再经碱性磷酸酶处理)通过连接酶作用嵌入其中, 两边噬菌体DNA部分称为左臂(L arm)和右臂(R arm). 2. M13 噬菌体载体 M13是一种有鞭毛的噬菌体, 含6.7kb的环状单链DNA. 感染大肠杆菌之后, 单链DNA复制为双链环状复制型, 每一大肠杆菌细胞约有100个噬菌体. 大肠杆菌受M13感染后不发生裂菌,但生长较慢而成为小菌落. M13噬菌体外壳蛋白质包装单链DNA后噬菌体颗粒以出芽的方式从细菌细胞中释出. 利用M13 DNA双链复制型, 嵌入一个含MCS和lacZ基因的DNA片段所构建的M13噬菌体载体, 可用蓝白斑的方式挑选出白色小菌落, 即含有重组体DNA的克隆. 含有M13复制起点的杂交质粒不能单独完成噬菌体的生命周期, 当与辅助噬菌体共感染之后, 辅助噬菌体基因表达所产生的外壳蛋白, 能包装杂交质粒与靶DNA 连接而成的单链重组体DNA. 第三节 人工载体: cosmid, YACs and BACs 质粒载体和噬菌体对外源DNA的容量有限. 真核生物基因由于内含子和间隔区的存在,以及多基因家族的克隆,需要较大容量的载体,特别是由于真核生物基因组庞大,制备其基因文库更加需要大容量的载体. 大容量的载体是完全人工组装的载体,如cosmids, YACs 和 BACs. 人工载体只含复制起点,限制内切酶切割位点,选择性标记,末端序列,其他序列基本被删除,以方便大片段靶DNA嵌入. 人工载体能携带较大的靶DNA进入宿主细胞中复制. 2. YACs (酵母人工染色体) 酵母染色体是较小的真核生物染色体,有边界清晰的序列保持其结构完整性、复制稳定性和准确分离. 这些序列包括：着丝粒、端粒和复制起点，这些序列能够单独分离出来，并被重组进质粒中，构建成酵母人工染色体. 酵母人工染色体（Yeast artificial chromosomes） 是利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。 pYACs 能像质粒那样复制，可容纳大至 1 Mb的靶DNA, 重组体pYACs能被转移到酵母细胞中复制. YAC上的标记基因 YAC 载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因 trp1、 leu2和 his3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石突变抑制基因 sup4 。 与 YAC 载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变 ade 2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制 ade2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。利用这一菌落颜色