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中国农业科学院研究生院 《基因工程原理》课程补充讲义 （三） 吴乃虎 （中国科学院遗传与发育研究所） 黄美娟 （北京大学生命科学学院细胞遗传学系） 2011年4月26日 DNA聚合酶 吴乃虎 （中国科学院遗传与发育研究所） 黄美娟 （北京大学生命科学学院细胞遗传学系） 一 DNA聚合酶 DNA聚合酶（DNA polymerase），也叫做依赖于DNA的DNA聚合酶（DNA-dependent DNA polymerase），或叫做DNA指导的DNA聚合酶（DNA-directed DNA polymerase），此外还有一种依赖于RNA的DNA聚合酶（RNA-dependent DNA polymerase）。这些核酸酶在原核和真核细胞中都有广泛的分布。根据氨基酸序列的同源性关系，可将各种DNA聚合酶，包括原核和真核的分为A、B、C、D、X、Y和RT（反转录酶）等7个不同的家族。反转录酶由于它能够用RNA为模板合成DNA，故也被归类为DNA聚合酶的一个家族。在分子遗传学研究中常用的DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶、Klenow大片段酶、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、修饰的T7 DNA聚合酶以及各种不同类型的真核DNA聚合酶。它们具有如下几个方面的基本特点。 第一，DNA聚合酶只能按照5，→3，的方向延长新生的DNA互补链。它能够根据与模板链上核苷酸碱基互补规则，按序把反应体系中游离的dNTP逐个地添加到生长链的3，-0H末端基团。换句话说，DNA聚合酶只具有催化新加入的dNTP分子的5，-P基团，与新生链自由的3，-0H末端基团之间形成磷酸二酯键的功能，而不具备催化新生链的5，-P基团与新加入的dNTP的3，-0H基团形成磷酸二酯键的活性。因此它不能够以相反的3，→5，的方向延长新生的DNA互补链。 第二，DNA聚合酶不能从头开始（de novo）合成新生的DNA互补链。已知在DNA聚合酶当中，除了参与RNA引物合成的聚合酶α/引发酶之外，所有的催化新生DNA互补链的合成，都必须有“引物”的参与。这种引物通常是一种RNA短片段，它务必在DNA聚合酶开始延长新生DNA互补链之前，就已经按照与模板链碱基互补的规则先期合成出来。DNA聚合酶能够识别RNA引物，并同其自由的3，-0H末端结合，在这种情况下才能够利用反应体系中游离的DNA结构元件dNTP，延长新生的DNA互补链。 第三，DNA聚合酶具有不同的持续合成能力（processivity）。当DNA聚合酶完成了一个核苷酸分子的参入之后，它或是先从DNA分子上解离下来，尔后再结合上去完成另一个核苷酸分子的参入；或者是继续保持结合状态，并沿着DNA模板链移动，到完成了多个核苷酸参入之后再解离下来。因此说，DNA聚合酶的解离与再结合的时间间隔，是其持续合成能力的制约因素。由此可见，所谓DNA聚合酶的持续合成能力，实质上是指在DNA聚合酶与DNA分子的一次结合的时间内，所能参入的核苷酸分子的平均数。不同类型的DNA聚合酶的持续合成能力相差悬殊，有的仅能参入少数几个或10几个核苷酸，有的则可参入高达数千个核苷酸分子。 第四，同一种DNA聚合酶往往具有多种不同的核酸酶活性。例如DNA聚合酶Ⅰ，除了具有合成DNA的5，→3，方向的聚合酶活性之外，还具有3，→5，方向的和5，→3，方向的核酸外切酶活性。前者这种外切酶活性，是构成DNA校正体系（proofreading system）的酶学基础；而后者这种外切酶活性，则可用于按切口平移的方法制备同位素标记的DNA分子杂交探针。再如DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ，也都具有5，→3，方向的聚合酶活性和3，→5，方向的外切酶活性，但与DNA聚合酶Ⅰ不同，它们二者都不具有5，→3，方向的外切酶活性。由此可见，在大肠杆菌DNA聚合酶当中，唯有DNA聚合酶Ⅰ才具有5，→3，方向的外切酶活性，可以用来在体外体系中向DNA分子参入具放射性同位素标记的脱氧核糖核苷酸。 1. 大肠杆菌DNA聚合酶 根据酶学特性、亚基组成和胞内含量水平三个参数划分，大肠杆菌DNA聚合酶至少有5种不同的类型，即DNA聚合酶Ⅰ（PolⅠ）、DNA聚合酶Ⅱ（Pol Ⅱ）、DNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）、DNA聚合酶Ⅳ（Pol Ⅳ）和DNA聚合酶Ⅴ（Pol Ⅴ）。下面主要讨论与DNA复制关系最为密切的PolⅠ和Pol Ⅲ两种DNA聚合酶。 （1）PolⅠ PolⅠ是美国生物化学家Arthur Kornberg及其合作者，于1955年从大肠杆菌中分离纯化的头一种DNA聚合酶，所以通常也叫做Kornberg酶。1957年，他们应用PolⅠ酶首次实现了DNA分子的体外合成。1959年，Kornberg因此