工业用微生物菌种课用资料.ppt

(五)分离和筛选 筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。 复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异. 例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。 （1） 营养缺陷型的选育 营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。 与营养缺陷型对应的是野生型。 能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基(MM)； 在基本培养基中加入相应的营养成分的称补充培养基(SM)； 能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。 营养缺陷型的用途 营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大。目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。要研究代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。 筛选营养缺陷型的步骤 诱变 淘汰野生型 检出缺陷型 确定生长谱 具体方法：影印法、点种法、夹层法 赖氨酸生产菌种的选育改良思路 出发菌株：黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌 育种思路 1.优先合成的转换——渗漏缺陷型的选育 2.切断支路代谢——营养缺陷型的选育：高丝氨酸缺陷型 3.抗结构类似物突变株的选育：AEC 4.解除代谢互锁：Leu- 、 抗Leu结构类似物、 喹啉s 、 苯醌s 5.增加前体物的合成和阻塞副产物的生成： Ala-、抗Asp结构类似物 选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株 6.改善细胞膜的透过机能 7. 选育温度敏感突变株 8. 应用细胞工程和基因工程育种 选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株 赖氨酸合成中间代谢有以下两条途径： ①通过TCA循环 葡萄糖 丙酮酸 草酰乙酸 天冬氨酸 赖氨酸 ② 通过磷酸烯醇丙酮酸羧化反应 葡萄糖 磷酸烯醇 草酰乙酸 天冬氨酸 式丙酮酸 丙酮酸 赖氨酸 代谢工程的定义 利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新的代谢途径，生产特定目的产物而发展起来的一个新的学科领域。 又称作途径工程，是多基因的基因工程。  代谢工程发展基础 代谢网络理论：是把细胞的生化反应以网络整体，而不是孤立地来考虑。 代谢网络分流处的代谢产物称为节点，其中对终产物合成起决定作用的少数节点称为主节点。 根据节点下游分支的可变程度，节点分为： 柔性节点： 解除一个分支的反馈抑制可提高该分支下游产物的产量。 半柔性节点：须降低主分支的酶活并同时提高次分支的酶活或解除其反馈抑制，才可提高次分支下游产物的产量。 刚性节点：其下游各分支的比例不易改变。 代谢工程发展基础 相依网络：代谢网络中各主节点集中于产物，为了避免中间物的过量积累，各分支的代谢流都必须保持平衡，各分支的分流相等，各节点的重要性相同。 独立网络：代谢网络的主节点不集中，可以通过对代谢的修饰来影响产物的产量,其对代谢修饰的应答能力，取决于各节点的刚柔性及其位置。 S I P S Ⅰ Ⅱ P Ⅱ B B1 B2 相依网路 独立网路 （三）代谢工程育种思路 1. 改变代谢流：改变分支代谢途径的流向，阻断有害代谢产物的合成。 （1）加速限速反应 （2）改变分支代谢途径流向：提高代谢分支点的某一分支代谢途径酶系的活力，在与另外的分支代谢途径的竞争中占有优势，可以提高目的代谢末端产物的产量。 （3）构建代谢旁路 （4）改变