PCR-课件要点.pptVIP

PCR实验技术 李颖 RT-PCR定义： 指对组织或细胞的总RNA进行抽提，把RNA反转录为cDNA，然后设计目的基因引物进行PCR，琼脂糖电泳并数码拍照，分析电泳条带灰度值，判断目的基因mRNA转录水平的相对量的变化。 PCR特点： 1.特异性强2.灵敏度高3.简便、快速4. 对标本的纯度要求低 一、抽提RNA： 三、PCR： PCR过程 PCR反应体系：　 10×扩增缓冲液 　 10ul　　　　 4种dNTP混合物 　 各200umol/L　　　　 引物 　　　　 　 各10～100pmol　　　　　 模板DNA 　　　 　0.1～2ug　　 　　　 Taq DNA聚合酶 　 2.5u　　　　　 Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L　　　　 加双或三蒸水至 　100ul PCR技术的应用 1. 遗传性疾病的基因诊断： PCR技术的应用 2. PCR反应在检测艾滋病中的应用 (传统的检测途经很多，包括外周血抗原测定，病毒分离和逆转录酶法等 ) （1）血清抗体阳性病人HIV序列的检测 (2)血清抗体阴性病人的HIV序列的检测 (3)新生儿HIV序列的检测 PCR技术的应用 3. PCR 在法医学中的应用 个人认识和亲子鉴定。 荧光定量PCR 实时定量PCR 1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。 实时定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。 实时荧光定量PCR的方法介绍 荧光定量PCR的优点：  1.高灵敏度，检测限度可达到10个菌/ml。 2.可进行准确的定量检测。用于基因诊断。 3.定量范围宽。 4.特异性更强，克服了假阳性。 5.防污染。 　 6.操作简便、耗时短 无须后处理和电泳检测。 7.安全，技术易于学习。　 1. 实时荧光定量PCR技术在医疗方面的应用  ⑴ 病原体检测 ⑵ 产前诊断 ⑶ 药物疗效考核 ⑷ 肿瘤基因检测 (5)在优生优育中的应用 2.实时荧光定量PCR技术在研究方面的部分应用 （1） 新药开发研究，人用药物及其他药物 （2）超早期感染用药物及疗法的研究与开发 （3）药物疗效研究，人用药物及其他药物 （4）新的愈后指标的研究 （5）新诊断及检验试剂的开发 （6）血液检验漏检率 * * * 高温 合成的引物 Taq酶 dNTP为原料 cDNA RT-PCR test RT-PCR (reverse transcriptase PCR ) 1、防止RNA酶污染 180℃的高温下干烤6hr以上； 0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗； 去污剂洗涤，双蒸水冲洗； 溶液皆用0.1% DEPC水配置，试剂应为新开封或RNA专用； 操作人员戴手套； 器械专用。 2、材料的准备 组织及细胞最好为新鲜的，或者在－70℃条件下保存半年以下； 尽量避免材料的冻融 。 3、确认RNA的质量 检测RNA溶液的吸光度： OD260/OD280=1.8－2.0 RNA的电泳图谱： 28S和18S条带明亮、清晰、指条带边缘清晰，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上。 单管一步法 反转录和PCR反应在一个管子中完成 ，得到的全部cDNA产物都一起经PCR扩增 ，灵敏度更高，但是容易相互干扰 。 两步法 反转录和P CR分开做，PCR取反转录反应产物的1/10进行，更为灵活而且严谨，但是灵敏度不如前者高。 二、反转录： 1、参照基因 PCR 参照基因一般选择看家基因（长表达、高表达量 的基因），常用18S、β－actin、bubulin、GAPDH，其中ACTIN最为普遍； 参照基因与目的基因在同一个管子内进行PCR反应的情况下，称之为内参； 参照基因与目的基因在不同管子内反应成为外参； 由于内参可能与目的基因竞争模板及酶，或造成其它干扰，外参的应用较为普遍。 2、目的基因 PCR 典型的引物18到24个核苷长，引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。 地中海贫血又称海洋性贫血是一组遗传性小细胞性