cas技术报告(结合文献)解读.ppt

第一细胞阶段的斑马鱼卵中，显微注射不同数量/浓度的以fh为靶向的（）和（），然后,我们评估了等位基因频率的改变在单一　　胚胎使用T7核酸内切酶我(T7EI)测定 * * 测定其稳定性 * * 2013年2月15日在《science》上发表的《Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems》一文中，作者利用一个包含两个靶向不同基因的spacers的crRNA实现了同时对两个基因进行编辑。 * 2013年3月26日的《Cell Research》杂志上《Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in Zebrafish embryos”》一文中，研究人员用特异的Cas/gRNA靶向斑马鱼胚胎中的etsrp、gata4或gata5时，获得了超过35%的位点特异性突变。 * 2013年4月12日在《cell stem cell》上发表的《Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs》一文中，作者利用TALENs和CRISPRs对同一基因进行修饰，效率分别为0%-34%和51%-79%。 * Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR- Cas system —— The type II Reporter：Zhang chi 2013/06/05 Genome editing with engineered nucleases 2011： zinc-finger nucleases，ZFNs transcription activator-like effector nucleases，TALENs engineered meganucleases CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats): Found in bacteria and archaea. Repeat：21-48bp (Highly conserved) Spacer：26-72bp（Identification of targeted genes） Basic structure of CRISPR-Cas ： Leader Spacer Repeat Cas genes CRISPR Basic structure of CRISPR-Cas ： Cas（CRISPR-associated sequences ）： Leader Spacer Repeat Cas genes CRISPR Bacterial type II CRISPR systems have been adapted to create guide RNAs that direct site-specific DNA cleavage by the Cas9 endonuclease in cultured cells. Found of CRISPR-Cas system ： Found of CRISPR-Cas system ： Immune system targeted genome editing ? 1.Construct expression vectors Cas9 nuclease expression plasmid 1.Construct expression vectors sgRNA expression vector 2.Determine the optimal quantity of each RNA Microinjection ： fh-targeted sgRNA and Cas9-encoding mRNA into one-cell-stage zebrafish embryos; the frequency of altered alleles in single embryos using a T7 endonuclease I (T7EI) assay sgRNA ：36.2 ng/ul Cas9 mRNA：100 ng/ul PAM:NGG The target site 3.Test the robustness of sgRNA:Cas9 sys