暴死的埃和塘虱病原菌的鉴定.docVIP

暴死的埃及塘虱病原菌的鉴定 革胡子鲶(Clarias gariepinus) 俗称埃及塘虱， 上世纪80年代从埃及引入我国。该鱼肉质细嫩，具有生长速度快，耐低氧，适合高密度养殖等特点，已成为我国多个省市淡水养殖的重要品种。近年来在革胡子鲶的养殖中，疾病发生有逐年增多的趋势。对革胡子鲶疾病的研究，国外已经报道的病原有细菌及寄生虫，其中嗜水气单胞菌(Aero-monas hydrophila)曾导致东南亚国家养殖革胡子鲶暴发溃疡性流行性疾病，给当地养殖业造成了严重的经济损失。但是国内对革胡子鲶疾病研究尚未引起足够的重视，对养殖中所发生的疾病种类、病因、病原的研究报道尚缺乏，导致养殖生产中对疾病防治缺少依据。2009年及 2010 年的11月间，山东潍坊某养殖场养殖的革胡子鲶成鱼进入越冬池后，发生急性出血性败血症，并导致暴发性死亡。该病传染性强、致死率高，给养殖生产带来极大的损失。为查明发病原因，本课题组对发病鱼进行了病因分析及病原的排查，对分离的可疑性病原进行了毒力验证及分类鉴定，并对分离菌株进行了药物敏感性分析，为该病防治提供理论依据。 1 材料和方法 1. 1 材料 患病革胡子鲶取自山东省潍坊市某淡水鱼养殖场，体长 35 ～40 cm，均具有典型发病症状。人工感染用健康革胡子鲶由潍坊某革胡子鲶育苗场提供，平均体长 15cm。攻毒前暂养于水族箱中，水温为 23 ～24℃，养殖实验用水为曝气 48 h 后的自来水，暂养 7 d 适应环境后供感染实验用。 1. 2 病症检查 取具典型发病症状的革胡子鲶，检查鱼体形态、皮肤、鳍、鳃丝等部位出现的异常变化，取少量异常组织做水浸片镜检;解剖鱼体，检查其内脏器官，并切取少量组织做水浸片镜检，记录各异常症状。 1. 3 病原菌的分离纯化 取濒死病鱼，用酒精棉球对鱼体体表和腹部消毒后，用无菌注射器抽取病鱼腹水，于LB平板划线分离;随后无菌解剖病鱼，剪取鳃、肝、肾、脾和腹部出血部位小块组织于无菌离心管中，参照范文辉等的方法于LB平板上作细菌分离。将分离后细菌平板置于28℃恒温培养20 h后， －80℃冰箱保存备用。 1. 4 病原菌形态观察 分离细菌划线接种于LB平板上，28℃ 培养18h后，按常规方法进行革兰氏染色和氧化酶试验，培养 24 h 后观察菌落形态。 1. 5 人工感染实验及细菌毒力分析 实验菌在 LB 培养基上 28 ℃纯化分离 3 次后，无菌生理盐水洗下菌落，稀释为 2 × 108、2 × 107、2 × 106和 2 × 105CFU /mL 菌悬液。腹腔注射感染健康革胡子鲶鱼( 0. 1 mL/尾) ，每组 10 尾，对照组注射等量生理盐水，每组设 2 个平行。感染后实验鱼置于水体 25 L水箱养殖，水温 23 ～24 ℃，每天投饵及换水吸污一次，养殖观察14 d，记录死亡鱼数，对死亡鱼进行解剖和病原菌再分离( 方法同1. 3) 。实验结束后用Reed ＆ Muench 方法计算半致死剂量( LD50) 。 1. 6 病原菌的鉴定 对目标菌株分别采用细菌全细胞脂肪酸鉴定系统( MIDI 公司，美国) 、Biolog 微生物自动鉴定系统( Biolog 公司，美国) 及细菌 16 SrDNA 序列分析3 种方法进行鉴定。细菌全细胞脂肪酸提取参照宋红梅等［10］方法，应用 Sherlock Microbial Identifica-tion System 软件( MIDI 公司，美国) 鉴定菌株。Bi-olog 细菌鉴定按 Biolog 系统操作手册 4. 2 版进行，简要过程为:细菌接种到鉴定板后30℃培养，分别于5h和20 h 用 Biolog 读数仪读数，用 BiologGENⅢ MicroStation软件鉴定菌株。细菌 16 S rDNA序列扩增按范文辉等的方法，PCR 产物测序由上海英骏生物技术有限公司完成，测序结果经BLAST 分析后，用Clustalx 1. 83 软件与 GenBank中相关菌株进行同源性比对，采用 Mega4 软件进行系统进化树建立、统计和聚类分析。 1. 7 细菌药物敏感检测 采用 KB 纸片扩散法: 取 LB 平板28 ℃培养20h 菌落，无菌生理盐水制成 1 × 108CFU / mL 菌悬液，每平板加 0. 1 mL 涂布 LB 平板，贴放药敏纸片，28 ℃培养 20 h 后测定抑菌圈直径。敏感度根据杭州微生物试剂有限公司提供的标准进行判定。 2 结果 2. 1 病症 鱼塘中发病革胡子鲶浮于水面，游动缓慢，病鱼下颌及鳍基部发红溃烂，严重者有血流出，腹部及体侧有点状充血，肛门红肿外凸，腹部膨大。解剖后可见病鱼肝脏呈土黄色; 脾脏、肾脏明显肿大，失去原有弹性，组织易破碎; 肠壁充血，腹腔内有大量含血的腹水，颜色暗红，粘稠度低。对鳃丝、溃烂皮肤