色谱柱的故障诊断与维护摘要.ppt

液相色谱柱部分 I. 常见问题 基线噪音 基线漂移 鬼 峰 峰 型 峰 型 峰 型 峰 型 峰 型 宽 峰 柱外体积效应的影响 I. 不进样时柱压连续升高 - 泵密封垫 - 流动相有颗粒 - 流动相溶解性 - 流动相的不稳定性 (聚合) - 形成柱死体积 (与使用条件有关) II. 进样时压力升高 - 样品有颗粒 - 样品在流动相中不溶 - 样品组分与固定相不兼容 I. 所有峰都向低保留值方向漂移（酸、碱、中性化合物） - 键合相流失 - 流动相不稳定 (可能性较小) - 溶剂输送系统 (流速变化) II. 所有峰都向高保留值方向漂移 - 在水/有机溶剂的混合体系中，有机溶剂含量减少 - 柱改变 (可能性较小) - 溶剂输送系统 (流速变化) III. 离子型化合物的色谱峰的保留值漂移 -流动相中挥发性组分损失 (离子强度, pH 漂移) - 柱改变 (键合相或污染) I. 与流动相有关的问题 - 使用新鲜的流动相 ?pH ?电导 ?色谱性能测试 II. 与色谱柱有关的问题 - 测试新柱 - 用标准的测试混合样测试新柱 - “清洗” 色谱柱后再测 - 考虑样品基质与使用条件对柱稳定性的影响 良好的柱使用规范 预柱与保护柱 制备样品: 流动相 在安装柱前后测试压力差 如果柱压力太高，反装色谱柱，并用10-20倍柱体积的流动相冲洗色谱柱，监测压力变化 若出现沉淀 (如：蛋白凝聚、细胞物、聚合物) 设法用相应的可溶性溶剂，如 0.1% TFA / 80% 乙腈, 6M 盐酸胍, THF, HFIP 若仍无效，应考虑更换过滤片 由于键合相的水解或硅胶的溶解而造成的色谱柱填料的变化是不可逆的 由于污染而产生的色谱柱变化可以通过适当的清洗使之修复 梯度洗脱的方式 (水 - 强有机溶剂) 通常最有效 低 pH 流动相, 如 0.1% TFA or 0.01M H3PO4, 也是有效的 升高温度（60-80℃） * 色谱柱的故障诊断与维护 可能的原因： 流动池脏 检测器灯有问题 如果是周期性的，则起源于泵的脉冲 温度对检测器的影响 气泡经过检测器 Time (min.) ? 梯度洗脱 ? 温度不稳定 (示差检测器） ? 流动相中有污染物 ? 柱中的流动相没有平衡 ? 体系中有污染物流出 可能的原因： 鬼峰——即使不进样也会出现的峰 20% - 100% MeOH 没有进样 60 15 30 15 0 3 7 15 17 问题1- 流动相脏 问题2- 样品过量 (也可能是回收率太差) 双 峰 柱 塌 陷 正 常 峰 双 峰 柱中有死体积 过滤片部分堵塞 只有一个双峰——组分的共洗脱 可能原因： 样品与溶剂不匹配 所有的峰都展宽 柱效降低——柱死体积 大进样量 / 质量 高捻度流动相 部分峰展宽 前次进样后流出的组分 大分子量样品——蛋白或聚合物 峰展宽 样品与流动相不匹配 拖尾峰 对称性 1.2 Normal Tailing Normal Tailing 原因： 部分峰拖尾 二次保留效应——残留硅醇基的反应 小峰紧跟在大峰的后面流出 柱头有污染 金属 所有峰拖尾 额外的柱效应 柱损坏 不适当的样品量/溶剂 正常峰 伸舌峰 前伸峰 不对称性 0.9 可能的原因 柱过载 在大峰前，有小峰流出 样品溶剂不适当 柱死体积 过滤片部分堵塞 原因 样品的吸收比流动相的吸收值低 当样品组分通过色谱柱时打破了原来的平衡 用示差检测器时是正常的 柱外体积增加 * 在进样口到柱或柱到检测器之间，使用细的短的连接管 * 保证所有的管路接头都使用正确 * 用小体积检测池 * 减少进样量 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 柱外体积 10 μL 20 μL Time, min. 2.1 x 150 mm F = 0.2 mL / min. (1ul 进样) 压力 保留值漂移 保留值漂移 使用新鲜的水溶液，并考虑使用生物稳定剂（如叠氮化钠） 储存色谱柱时，应冲净缓冲言，并用有机溶剂饱和色谱柱（乙腈） 避免外力损伤色谱柱：弯曲、跌落或将接头拧的过紧 完全润湿在运输中变干的色谱柱 对含有保留性较强的杂质组分的样品要进行预处理 定期用强极性的溶剂清洗色谱柱 清除柱填料的局限性 了解溶剂对样品的溶解性及分离的影响 pH 温度 化学兼容性 在使用前过滤溶剂 从泵来的流动相 预柱 进样器 保护柱 分析柱 到检测器 预柱对流动相而言 保护柱对色谱柱而言 Stripping or