流式细胞术原理及基本应用.pdfVIP

流式细胞术原理 及基本应用 孙继萃 2011-3-3 流式细胞仪工作原理简介 • 流式细胞术 （Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快 速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞） 的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加 以分选。 • 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成 微球等。 • 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定 量。 为什么要使用流式细胞术 • 快速 能够检测样本100个/秒 • 准确 可以获取大量样本以提高实验的统 计学准确度 • 敏感 比肉眼更为敏感 • 高效 可同时检测多个参数 流式细胞仪的基本构成 荧光信号— 电信号—数字信号 现在普遍使用的激光器 • –488 nm Blue （可以激发90% 以上的荧光染料） • –633 nm Red (激发APC 染料) • –405/407/408 nm Violet • –532 nm Green • 325 nm UV or ML UV(For DAPI, Hoechst 33342) 散射光信号 荧光信号 荧光信号 – FL 1 : (525 nm BP) for green dyes –FL 2 : (575 nm BP) for yellow dyes –FL 3 : (615 nm BP) for orange dyes –FL 4 : (675 nm BP) for red dyes – FL 5 : (750 nm BP) for deep red dyes 流式细胞仪主要组成原件 • 液流系统 • 光学系统 • 电子系统 • 计算机系统 • 分选系统 液流系统：流体动力聚集 液流系统：流体动力聚集 Sheath Sample 光学系统 SSC detector Laser FSC detector 光学系统： 利用濾片將螢光區分至個別的偵測器中 电子系统：光电倍增管（PMT）和放大 信号（High Voltage） 明确的概念 • 激发光：激光器发射，单波长光源 • 发射光：荧光信号的接收器接收，宽频波 长信号 • 信号放大High Voltage可调节 流式细胞术的基本应用 • 单一细胞的单荧光染色 • 双荧光及多荧光染色 • 细胞周期测定 单一细胞的单荧光染色 什么是荧光强度？ 双荧光及多荧光染色 71.14% 20.79% 为什么我们需要进行荧光信号的补偿调节 FL1 PMT：92 ＝90+2 FL2 PMT：100＝85+15 细胞周期检测 • 原理 • PI ,即碘化丙锭,可以与细胞内DNA和RNA结 合, PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量 的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不 同,通常正常细胞的G1 /G0期具有二倍体细胞 的DNA含量(2N) ,而G2 /M期具有四倍体细胞 的DNA含量(4N