家蚕septinlike基因的克隆及原核表达.doc

安 徽 农 业 大 学 毕 业 论 文（设计） 论文题目 家蚕septin4-like基因的克隆及原核表达 姓 名 王 娜 娜 学 号 院 系 生命科学学院 专 业 生物类创新 指导教师 王 磊 职 称 讲 师 中国·合肥 二o一四 年 五 月 安徽农业大学学士学位论文（设计）开题报告 课题名称 家蚕septin4-like基因的克隆及原核表达 课题来源 自选 学生姓名 王娜娜 专业 生物类创新 学号 指导教师姓名 王磊 职称 讲师 研究内容 家蚕septin4-like基因的克隆 家蚕septin4-like基因的原核表达 研究计划 2013.4.01-2013.4.15 搜集实验原料，查询相关资料，制定实验方案，进行实验. 2013.4.16-2014.5.20 实验方案的分步实施，写实验记录。 2014.5.21-2014.6.07 分析实验记录，撰写论文初稿。 修改论文并定稿，进行答辩。 特色与创新 指导教师意见 教研室意见 学院意见 主要领导签名： 年 月 日 目录 前言： 4 1材料与方法 6 1.1实验材料 6 1.2仪器与试剂 6 1.2.1主要的实验仪器 6 1.2.2 主要生化试剂 6 1.2.3 常用溶液的配置 7 1.3实验方法 9 1.3.1对家蚕Serpin4基因进行序列分析 9 1.3.2家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Serpin4的克隆 9 1.3.3总RNA的质量检测 10 1.3.4RNA的反转录 10 1.3.5引物的设计与PCR扩增目的片段 10 1.3.6目的片段的分离与纯化 11 1.3.7家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Serpin4表达载体的构建 12 1.3.8试剂盒进行质粒的提取 12 1.3.9目的片段和pET28a的双酶切 13 1.3.10连接目的基因和表达载体 13 1.3.11表达产物的SDS分析 13 1.3.12 Western Blot 14 2.结果与分析 14 2.1家蚕Serpin基因序列分析 14 2.2家蚕总RNA的检测 17 2.3第一链cDNA浓度的测定 18 2.4家蚕Serpin4基因的PCR扩增结果 18 2.5原核表达载体的构建 18 2.5.1家蚕Serpin4基因与克隆载体pMD-19T连接鉴定 18 2.5.2 Serpin4与表达载体pET-28a（+）、pMD19T连接鉴定 19 2.5.3 Western blot检测 20 3.讨论 20 参考文献 21 致谢 24 家蚕septin4-like基因的克隆及原核表达 8-9个a螺旋(termedhA-hI)，在近C端有一个活性螺旋中心(RCL)，一般由17个氨基酸组成，连接β-sheetsA和C，是蛋白结合和裂解位点。在抑制型Serpin中这段序列是保守的，在非抑制功能的Serpin中该序列是有差异的。 Serpin是通过一种自杀性底物的方式发挥它的蛋白酶抑制的作用。在自然地状态下RCL呈现为展开的状态，构想暴露。把RCL中被酶识别并且切断的肽键两端的氨基酸成为P1和PA’。近氨基端的氨基酸称为P1，远离的一段称为P1’，以此类推下去肽链结构可以表示为N端P14-P8-P1-P1’-P8’-P14’-C端。对应的蛋白酶作用位点是S1，S2。RCL被靶蛋白酶识别后，形成了特异性复合物。P1-P1’将会被激活的丝氨酸残基攻击，随后RCL断裂，氨基末端插入了β折叠A的中心部位形成了新的羧基末端S4A。这个时候构成的复合物的抑制剂和蛋白酶结构全部发生了变化，蛋白酶的催化活性失去。 Serpin在昆虫的黑化等免疫反应中起着至关重要的作用，与昆虫的免疫防御反应有着密切的联系，Serpin对于昆虫的生命活动十分重要。众所周知，昆虫是地球上最繁盛的，种类也是最多的一个种群，在生态系统中占有重要的位置，但是目前对于昆虫的Serpin的研究也只是仅限于几种特定的昆虫，其新的基因的结构、功能和调控的研究较少，对于有些基因的功能机制还有许不知的地方。 昆虫的黑化包裹反应就是它在抵御病原菌感染的最为重要的免疫防御机制，寄生虫或者是病原体在被识别后将会发动昆虫酚氧化酶原的激活系统（proPO系统），首次是激活SP级联，PPO、多巴脱羧酶、芳香烷基-N-乙酰基转移酶、多