对虾白斑综合症病毒(WWSV)衣壳蛋白Vp28的纯化与多克隆抗体的制备_new要点.docVIP

对虾白斑综合症病毒（WWSV）衣壳蛋白Vp28的纯化与多克隆抗体的制备 班级： 2 姓名： 学号： 2 同组者： 对虾白斑综合症病毒（WWSV）衣壳蛋白Vp28 纯化与多克隆抗体的制备 摘 要：对虾白斑综合征病毒（ WSSV） 是一种能快速繁殖并且传播的病毒，它感染的宿主范围很广，而且致死性很高，严重危害虾蟹养殖业，衣壳蛋白VP28是WSSV病毒粒子的一个重要的囊膜蛋白。本试验成功构建了VP28的原核表达体系，并对表达的蛋白进行亲和纯化，最终成功制备了VP28的多克隆抗体，为进一步研究对虾白斑综合征病防治措施的免疫试验提供抗体和依据。 关键词：Vp28 WSSV 亲和纯化 多克隆抗体 1 引言 对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是引起包括中国在内的东亚及东南亚地区养殖业对虾暴发性流行病的主要病原体，可造成大面积对虾死亡，带来巨大的经济损失。白斑综合征病毒于1992 年在中国台湾首次被发现,随后迅速扩散到日本和东南亚地区[1]。WSSV是一种无包涵体、具囊膜、一端有尾巴状结构、杆状的双链环状DNA病毒[2],毒力极强,宿主范围较广泛，可造成对虾厌食、空胃、红体和白斑。WSSV的DNA分子长度为305Kbp,约有181个开放阅读框,其病毒粒子至少包含5种结构蛋白,分子大小分别为:28kDa(VP28)、26kDa(VP26),24kDa(VP24),19kDa(VP19)和15kDa(VP15),其中VP28和VP19是囊膜蛋白，VP26/VP24、VP15是核衣壳蛋白。VP28 是对虾白斑综合征病毒的主要囊膜蛋白,研究证实VP28 是对虾致病的主要蛋白之一。vp28首先由Mari?lle C.W van Hulten从纯化的病毒中分离并进行蛋白N-末端测序[3],他们发现抗VP28的动物血清对于WSSV具有中和作用,这显示VP28可能在WSSV的吸附与入侵中具有关键作用[4]，而且研究发现，VP(19+28)融合蛋白的抗血清在15~22℃对对虾抗WSSV有100%的保护率,在26℃时有65%的保护率[5]，所以vp28的诱导表达以及抗体的制备对对虾养殖业有重大意义。 本次实验我们成功构建了VP28的原核表达体系，并使蛋白得到大规模表达，最后用纯化后的蛋白成功制备了多克隆抗体，并对其进行了检测，为深入研究 WSVV 的致病机制和开发新型生物制剂奠定基础。 2 材料与方法 2.1 材料 pGEX -4T-1载体、限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ、Amp、表达菌株BL21( DE3)、EK 蛋白酶、 新西兰大白兔、 弗氏佐剂( Sigma)、 氨苄青霉素、 丙烯酰胺和N,N - 亚甲双丙烯酰胺、 十二烷基硫酸钠SDS溶液、 分离胶缓冲液、 浓缩胶缓冲液、Tris - 甘氨酸电泳缓冲液、SDS - PAGE 加样缓冲液、 转移缓冲液、 脱脂奶粉、 过氧化物酶标记的第二抗体、 考马斯亮蓝、及其他药品。 e) 亲和纯化试剂： Ni-NTA亲和柱 10×PBS：80g NaCl，2g KCl，14.4g Na2HPO4，2.4gKH2PO4，双蒸水定容至1L。(各组分的终浓度为 1.37MNaCl，27mMKCl，101.4mMNa2HPO4，17.6mMKH2PO4，此时pH为6.7，用时稀释十倍，pH变为7.4) 8×平衡缓冲液100mL：13.3g 2.4MNaCl,4.8g 400mMNaH2PO4,0.544g 80mM咪唑,0.9691g 80mMTris,1.5gNaOH，溶于80mL蒸馏水，用1MNaOH调PH至8.0，用水定容到100mL，使用时稀释成1× 8×Wash Buffer 100mL：13.3g 2.4MNaCl,4.8g 400mMNaH2PO4,3.264g 480mM咪唑,0.9691g 80mMTris,1.5gNaOH，溶于80mL蒸馏水，用1MNaOH调PH至8.0，用水定容到100mL，使用时稀释成1× 4×Elute Buffer 100mL:6.9g 1.3MNaCl,2.4g 200mMNaH2PO4,27.2g 4M咪唑,0.4846g 40mMTris,用浓盐酸调PH至8使用时稀释成8.0，使用时稀释成1× 梯度洗脱液： Elute Buffer Wash Buffer 1/20 150μL 2.85mL 1/10 300μL 2.7mL 2/10 600μL 2.4mL 3/10 900μL 2.1mL 4/10