贵州大学生物显微及超微技术实验教学大纲(超微技术部分)要点.docVIP

贵州大学生物显微及超微技术实验教学大纲 （超微技术部分） 一、 教学目的与要求 掌握透射电镜和扫描电镜的基本知识；了解透射电镜和扫描电镜的工作原理；了解其它新型电镜；掌握样品常规制备技术；了解免疫电镜、电镜细胞化学、冷冻蚀刻等技术；掌握正常细胞超微结构；了解细胞超微结构病理形态。使学生掌握电镜在生物医学领域中的使用方法。二、课程内容 实验名称 备注 实验一 透射电镜、扫描电镜的结构与工作原理介绍 电子显微镜的常规制样技术介绍 2学时 实验二 植物花粉、叶片的扫描电镜观察 4学时 实验三 微生物、动物的扫描电镜观察 4学时 实验四 微生物样品（细菌、病毒）的负染色制备与观察 6学时 实验五 超薄切片技术 10学时 实验六 细胞超微结构的透射电镜观察 6学时 教师：刘忠伟 电话 E-Mail 实验一 透射电镜、扫描电镜的结构与工作原理介绍 电子显微镜的常规制样技术介绍（理论课） ㈠ 序言 1．电镜发展史 2．电镜在生物医学中的作用 3．电镜进展：超高压电镜、扫描透射电镜、扫描隧道显微镜、分析电镜等 4．电镜与其它显微镜的区别 ㈡ 透射电镜 1．概述 2. 基本原理 3．结构和操作 ㈢ 扫描电镜 1．概述 2．成像原理 3. 结构和操作 ㈣ 超薄切片技术 1．电镜对标本的要求 2．标本制备过程 3．人工假象问题 ㈤ 扫描电镜样品制备 1．取材和予处理 2．生物样品干燥 3．生物样品导电 ㈥ 免疫电镜 1．概述 2．方法 3．免疫金探针技术 ㈧ 细胞超微结构 1．正常细胞超微结构 2．超微结构的病理变化 3．人工假象 实验二 叶片气孔及表皮细胞、花粉的扫描电子显微镜观察 一、 教学目的与要求 掌握扫描电镜的基本知识工作原理掌握样品常规制备技术；了解态。二、课程内容 取成熟植物叶片清洗后，切取中部约5mm 长的小段，经2.5％戊二醛4℃固定12 h以上，用0.1mol/L磷酸缓冲液（PBS）清洗1次。 于26℃（即叔丁醇液态之温度）条件下用30%、50％、70％、90％的叔丁醇/酒精混合液各脱水5min；100％叔丁醇脱水两次，每次5min； 将试管中叔丁醇抽干，置4℃ 5～10min，待叔丁醇变为固态，冷冻干燥30～60min； 将脱水处理过的样品用导电胶粘在样品台上，离子溅射仪镀金膜，S-3400N扫描电镜观察并拍照。 2、花粉： 取新鲜成熟的花粉，置于防尘处自然干燥（因花粉含水量少，可以采用直接干燥法观察）。 而后粘于导电胶上，用离子溅射仪镀金膜，扫描电镜观察并拍照。 实验三 微生物、小动物的扫描电子显微镜观察 一、 教学目的与要求 掌握扫描电镜的基本知识工作原理掌握样品常规制备技术；了解态。二、课程内容.5％戊二醛在4℃条件下固定12 h，用0.1mol/L磷酸缓冲液（PBS）清洗数次，以便洗去固定剂；然后用1%锇酸溶液后固定1h，0.1mol/L磷酸缓冲液（PBS）清洗数次。 在叔丁醇液态条件下用30%、50％、70％、90％的叔丁醇/酒精混合液各脱水5min；100％叔丁醇脱水两次，每次5min； 将试管中叔丁醇抽干，置4℃ 5～10min，待叔丁醇变为固态，冷冻干燥30～60min； 将脱水处理过的样品用导电胶粘在样品台上，离子溅射仪镀金膜，S-3400N扫描电镜观察并拍照。 2、小动物及动物组织的制样方法： 取样品清洗后，用2.5％戊二醛4℃固定12 h以上，再用0.1mol/L磷酸缓冲液（PBS）清洗数次，然后用1%锇酸溶液后固定1h，0.1mol/L磷酸缓冲液（PBS）清洗数次。 余下的步骤与1相同。 实验四 负染色 一、 教学目的与要求 掌握电镜的基本知识工作原理掌握制备技术；了解态。二、课程内容 图片：负染色的腺病毒 实验五、超薄切片技术 一、 教学目的与要求 1.?掌握超薄切片的基本要求和制作程序。 2.?掌握取材的基本方法和要求。 3.?掌握常用的固定剂及固定方法。 4.?了解脱水、浸透与包埋、切片、染色等的基本操作方法和注意事项。二、课程内容1.?超薄切片的概念和基本要求，基本制作程序。 2.??取材的概念，取材前的准备工作，取材的基本要求和方法。 3.??固定的目的，理想的常用固定剂及其配制，固定的方法和固定时的注意事项。 4.?脱水的目的，常用的脱水剂，脱水方法和脱水时注意的问题。 5.?浸透与包埋的目的，常用的包埋剂，浸透和包埋的方法，包埋中应注意的问题。 6.?切片的步骤，玻璃刀的制作，切片厚度的简单识别方法。 7.?切片的目的；正染和负染的概念；醋酸双氧铀—柠檬酸铅双染法中染色剂的配制、染色步骤、方法及注意事项。 8. 超薄切片质量的判断。透射电镜标本制备和观察 1取材（等）2、固定3、脱水4、浸透