生化仪应用_new教程.doc

生化分析仪的基础与应用 生化分析离不开生化分析仪。所谓生化分析一般是指以吸光光度分析为基础的（有的包含离子选择电极等测定方法）、具有样品取样及加试剂、混合、保温反应等测定。分析过程监控和数据处理及输出能力的半自动或全自动仪器。它们的分析方法都以仪器和试剂为基础，以方法学为指导标准来规范，以试验参数来联系体现。所以，首先必须了解仪器、试剂和方法学的原理及特点，其次是利用方法学评价对仪器、试剂及参数在实践中作评价，以保证分析的精密度和准确度，提高成本效益。 实验证明，单色光经过有色溶液时，透过溶液的光强度不仅与溶液的浓度有关，而且还与溶液的厚度以及溶液本身对光的吸收性能有关。其规律可用下式表示为 A＝KCL 式中：A（E）——吸光度（或叫做光密度，也可用D表示）； K——某溶液的消光（吸收）系数； C——溶液的浓度； L——光程，即溶液的厚度。 可见、收光谱法的定量基础是朗伯比尔（Lambert-Beer）定律： A=lgI o/ I t =-lgT=lg1/T 吸光系数即当一束强度为L的平行单色光通过一个含有浓度为C的吸光物质、厚度为L的吸收他时，光的一部分被吸收，光强度从IO减小至It。当吸光系数k一定时，透过光与浓度或厚度呈指数函数关系，但吸光度（absorbance，A）与浓度或厚度呈简单的正比关系。 在浓度、厚度、单色光波长、溶剂及其温度等相同条件下，不同吸光物质的吸光度不同，即它们的吸光系数（absorptivity）不同。是物质的特性常数，它只和该物质分子在基态和激发态之间的跃迁几率有关。它的物理意义是吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度，常用的表示方式是摩尔吸光系数（molar absorptivity）。摩尔吸光系数即1摩尔浓度的溶液在厚度为 1cm时的吸光度。在吸光度与浓度之间的直线关系中，吸光系数是斜率，其值愈大，测定灵敏度愈高。 应用注意点： 1．由于物质对不同波长的光有不同的吸光系数，Beer定律成立的重要前提之一是单色光，即只有一种波长的光。但在实际测定中，入射光常常并非严格的单色光，常有不同波长的辐射同时存在。此种多色辐射是使测定中吸光度的变化偏离Beer定律（常为负偏离）的主要光学影响因素。单色光的纯度可用谱带宽度（bandwidth）衡量。单色光源是用分光光度计由单色器或滤光片从连续光谱的多色光中选择的、最大吸收波长λmax在内的一小段波长范围的复合光。以谱带宽度较小、吸收峰较宽的λmax作为测定条件。 2．Beer定律一般适用于稀溶液的测定 有两层含义：被测物的浓度不宜过大，其吸光度应在相对测量误差较小的区域；溶液在反应中存在化学平衡，受浓度、pH、溶剂和温度等因素的影响。 3．介质不均匀引起偏离 当待测试液是胶体溶液、乳浊液或悬浮液时，入射光因一部分散射损失，使透光率减小，实测吸光度增加。 比浊法及免疫浊度反应的特点 比浊法与可见、紫外吸收光谱法不同，它们不是测定澄清溶液而是测定悬浮液或胶体溶液中物质的浓度，分析的光学基础是分散颗粒对光的反射、折射、散射和吸收等多种作用。生化分析仪通过免疫比浊法等技术，架起临床生化与现代免疫技术的桥梁，免疫化学法的应用日益广泛。 1．比浊法的分类及原理在光源的光路方向上测量透射光（实际包括透射光和散射光）强度与入射光强度的比值和被检溶液中颗粒浓度间的关系，称为透射比浊法（turbidimetry）。在光路的一定角度（一般为5o－90o）方向上测量散射光强度和被检溶液中颗粒浓度间的关系，称为散射比浊法（nephelometry）。 透射比浊法的计算公式是： In（IO／I）＝　τb 令τ=2．3kc lgI o/ I＝ kbc 即当一束强度为I o的平行光通过一个散射颗粒浓度为c混浊介质厚度为b的稀的悬浮液后，人射光被吸收和散射，光强度衰减至I，在浊度系数为τ时，透过率与颗粒浓度呈线性关系。 散射光强度与悬浮液或胶体溶液中的颗粒质点大小、入射光波长大小及二者的比例有关。颗粒直径接近或大于光源波长时，常呈透射光和光路上的向前散射光，其散射光强度与入射光强度的关系遵从Mie散射理论，光散射随波长的变化小。颗粒远小于光源波长（d小于0．05λ）时常呈偏离光路方向、900对称分布的散射光，其散射光强度与人射光强度的关系符合Rayleigh散射定律，波长愈短，散射光愈强。 一般比浊法的灵敏度不如可见、紫外吸收光谱