Western_blot原理和技术(上课)概要.ppt

* 半干转移用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。因为电极板直接与滤纸接触，使凝胶中电场强度尽可能大以快速高效转移。与湿转相比，这种方法又快（15-45 分钟）又好。多数半干转移方法使用一种以上的缓冲系统，可以同时高效转移大小不同的蛋白。然而，半干转移系统因缓冲液较少不适于长时间转移。 半干转操作步骤与湿转基本类似，区别在于两边都是3层Whatman 3#滤纸，转移电压和时间也有所不同。 半干转移系统中，滤纸和膜切成与凝胶相同大小很重要，这样电流必须通过凝胶。否则，在凝胶边缘处滤纸重叠将导致电流短路。 两种转移系统中都必须注意防止在滤纸、凝胶和膜之间的任何地方存在气泡，气泡阻碍转移并在印迹膜上产生“秃斑”（即非转移区）。 小分子量的蛋白半干转效果比较好，大分子量（100KD以上）建议湿转。 * 转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的TBST（或PBST）中漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。 从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。 转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。 印度墨汁不能和化学发光物合用，若是使用呈色反应的酶检测法时，印度墨汁的黑色会使凝胶难于拍照。这时，可改用其他检测方法或换用丽春红S。 转膜后检测，多用丽春红染色，可见多条粉红色条带。 按照所检测蛋白分子量大小切下膜条，做好标记。 * 4. 封闭(Blocking) 杂交膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。常用的封闭试剂有 5%的 BSA 或者脱脂奶粉，缓冲液一般选择 PBST 或者TBST。 将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TBST稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TBST将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。 一般封闭条件为：室温或者 37℃缓慢摇荡1～2h，特殊情况也可 4℃过夜。根据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型。比如有时 BSA 比脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背景。 封闭完成后要进行洗膜，以去除膜上未结合的封闭试剂。洗涤液使用TBST 或者PBST。 * 5. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 5.1 参考一抗的说明书，按照适当比例用封闭液稀释一抗。5.2 吸尽封闭液后，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在摇床上缓慢摇动孵育1～2小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。5.3 回收一抗。然后加入Western洗涤液，在摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 6.1 参考二抗的说明书，按照适当比例用封闭液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。 6.2 吸尽洗涤液后，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在摇床上缓慢摇动孵育1～2小时。 6.3 回收二抗。然后加入Western洗涤液，在摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 前2步洗涤是为了洗去一抗和二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。洗涤液使用 TBST 或者 PBST，其中的 Tween20 有助于去除非特异性的结合，减少背景。同时短时间多次的洗膜（如 5-6次，每次 3分钟）比长时间少次数的洗膜更有效。 第3步TBS洗涤是为了洗去膜上的Tween20，因为它可以阻碍底物的沉积。 一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景的深浅。要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；还要注意一抗二抗的匹配。 * 7. 蛋白检测(Detection of proteins) 在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐(