TALEN的应用(重要!!)教程分析.pptVIP

* 钟洁 2014.11.7 新技术介绍 TALENs基因靶向修饰技术 Transcription activator-like effectors nucleases 汇报人：钟洁 时间：2014年11月7日 2011年8月来自Sangamo BioSciences公司和哈佛大学的两个研究小组分别利用TALENs技术进行了基因组靶向修饰相关研究，并成功敲出了人类细胞靶向基因和调控内源性基因的转录。两篇研究论文发表在同一期的《Nature Biotechnology》杂志上。 这一技术也为科学家们开发出更简易的新型基因组靶向修饰技术带来了新希望。 1 TALENs技术 2009 年，Boch等和Moscou等关于黄单胞菌效应子蛋白 TALE（transcription activator-like effectors）与寄主靶基因 DNA特异性识别分子密码的破解，使植物基因组定点改造呈现出新的曙光。 1 TALENs技术 TALENs靶向基因修饰技术是基于TALE核酸酶（TALENs）的一种崭新的分子生物学工具。 TALENs是TALE蛋白和Fokl核酸内切酶的剪切结构域组成的嵌合融合蛋白, 其中TALE蛋白结构域负责识别靶位点，Fokl核酸内切酶负责切割DNA双链, 从而造成双链断裂(DSB)，诱发DNA损伤修复机制，形成基因敲除突变体。 1 TALENs技术 1.1 TALE nuclease结构 TALENs主要由两部分组成： DNA识别区（TALE蛋白）：TALE蛋白是由植物病原体黄单胞菌属分泌的一种蛋白,能特异性的识别并结合 DNA 序列。 剪切结构域（Fokl）：Fokl则可通过二聚化产生核酸内切酶活性, 在该序列附近造成 DNA 的双链断裂(Double-stand break, DSB)。 1.2 TALE蛋白 TALE蛋白是由12个或以上特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成。 每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，第12和13位残基是靶向识别的关键位点，决定了TALE与DNA结合的特异性，被称作重复可变的双连氨基酸残基位点（Repeat Variant Di-residue, RVD） 。 每个蛋白模块上RVDs对应识别一个碱基。 1.2 TALE蛋白 1.3 Fokl核酸内切酶 Fokl酶只有形成二聚体时才具有酶切活性，所以每次必须设计一对TALENs，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔17碱基）的靶序列（一般十几个碱基）分别进行TALE识别模块构建。 TALENs和ZFNs使用相同的Fokl酶 TALENs ZFNs 2 基因敲除步骤 TALENs靶点识别模块构建 TALENs质粒对共转入细胞 目标基因敲除突变体筛选 TALENs表达质粒构建 TALENs靶点识别模块构建 TALENs质粒对共转入细胞 目标基因敲除突变体筛选 TALENs表达质粒构建 2.1 TALE 靶点识别模块构建 TALE的核酸识别单元为间隔32个恒定氨基酸序列的双连氨基酸（RVDs）。RVDs与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NG识别T， HD识别C， NI识别A， NN识别G/A。 欲使TALE特异识别某一核酸序列（靶点），只须按照靶点序列将相应TALE单元串联克隆即可 。 TALENs靶点识别模块构建 TALENs质粒对共转入细胞 目标基因敲除突变体筛选 TALENs表达质粒构建 2.1 TALE 靶点识别模块构建 单元组装法 Four basic single-unit vectors TALENs靶点识别模块构建 TALENs质粒对共转入细胞 目标基因敲除突变体筛选 TALENs表达质粒构建 2.1 TALE 靶点识别模块构建 TALENs靶点识别模块构建 TALENs质粒对共转入细胞 目标基因敲除突变体筛选 TALENs表达质粒构建 2.1 TALE 靶点识别模块构建 TALENs靶点识别模块构建 TALENs质粒对共转入细胞 目标基因敲除突变体筛选 TALENs表达质粒构建 2.1 TALE 靶点识别模块构建 这样，我们就按照靶序列把一个个质粒串联起来，由于TALE蛋白中的各个蛋白模块的RVDs与A、G、C、T有恒定的对应关系，所以质粒编码的蛋白就能特异性的结合靶序列。 TALENs靶点识别模块构建 TALENs质粒对共转入细胞 目标基因敲除突变体筛选 TALENs表达质粒构建 靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中，此真核表达载体含有Fokl内切酶序列和其它必需结构域，包括5’端序列和3’端序列。 2.2 TALENs表达质粒构建 TALENs靶点识别模块构建 TALENs质粒对共转入