研修班__基因分析__20131124.ppt

“备”则“倍” 有准备、有规划的人生更精彩！ 片段文库，配对末端文库 2-10kb，环化，ecop15i、。 片段文库，配对末端文库；选择哪种文库，看老师的意向信息。 适合全基因组测序的组装 P7接头 P5接头设计了高碘酸盐的线性化切割位点，在后续的过程中进行切割线性化。 变性洗脱后，新合成的链就会继续与flowcell上的其他因为进行碱基互补配对，从而形成一个bridge，然后以这条链为模板形成一个bridge pcr的过程。 第2轮，变性打开，分别以2条链为模板，分别进行新一轮的桥式pcr过程 多轮循环后，我以一个簇的一对双链为例，cluster制备后，上级测序，P5因为带有高碘酸盐的线性化切割位点，加如特殊的化学试剂，对这个位点，进行线性化的切割。切割后在这个链的3‘端，加入ddNT，防止这条链进一步延伸。在经过变性洗脱的过程就会只剩下长在P7因为上的这条链，然后加入测序反应物，DNA聚合酶，4色荧光标记的DNTP， 两端都加上测序接头 P5 尿嘧啶的特异性的切割位点 P7糖基化酶的切割位点 从测序的地方开始说，对P5引物的尿嘧啶线性化切割位点进行切割，将线性化的链洗掉。 将新合成的100bp的链进行变性洗脱，然后 * 待测模板结合到带有P1引物的磁珠上，乳液pcr的扩增过程，基于DNA连接酶，不是通常我们用的DNA聚合酶 * 片段，配对末端 * * 磁珠、待测模板、PCR反应元件 * * 乳液PCR反应放在数目巨大的独立反应空间内，开始是一个注水倒油的过程。在PCR反应之前，将反映容易注入到高速旋转地矿物油表面。 * * 经过多次扩增后，。。 * * 甘油的梯度密度离心 * * 将磁珠的3，-进行修饰，与上样玻片共价结合 二代测序技术 - ABI SOLiD – step5 连接测序 二代测序技术 - ABI SOLiD 四、蛋白质的分析方法 蛋白质的定量分析： ELISA(Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay) Western blot 蛋白质的定位： 免疫组织化学 荧光蛋白的活细胞定位 蛋白质相互作用的研究 蛋白质功能的研究 蛋白质组学技术 Proteomics 蛋白质组与蛋白质组学： 对特定组织细胞总蛋白的整体性研究 蛋白质组学研究的目的什么？ 解读基因组：基因组编码了多少基因？ 蛋白表达：比研究 RNA 表达深入了一步 蛋白功能：超过 1/3 的蛋白质功能不明确 蛋白质修饰：糖基化、磷酸化、酶解等 蛋白质定位：subproteome 蛋白-蛋白相互作用：互作是功能的基础 (1) 蛋白质组学的核心技术是什么？ 1975 年，双向电泳技术建立 1990 年，更新的 Edman 降解法用于微量蛋白质测序，灵敏度达到 pmol 级 质谱技术使蛋白测序灵敏度达到 fmol 级 基因组计划提供了大量的生物信息 双向电泳＋质谱＋生物信息分析 双向电泳 等电聚焦＋SDS双向电泳的优点与缺陷 优点： 比单向电泳有更高的分辨率 缺点与解决办法： 无法检测低丰度蛋白：分组检测 无法检测大分子量或脂溶性蛋白：酶解 电泳图谱解读困难：自动化分析、DIGE Difference gel electrophoresis (DIGE) Mass spectrometry 肽质谱(MS)：分析混合多肽 只能确定氨基酸组成，不能分析序列 氨基酸质谱：分析单一肽的氨基酸序列 串联质谱(Tandem mass spectrometry，MS/MS) 可以分析氨基酸序列 通过与数据库比较确认肽的来源 MS 与 MS/MS MS/MS (2) 如何进行蛋白-蛋白相互作用的分析？ 酵母双杂交(yeast two-hybridization) 噬菌体展示文库(phage display library) 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation) 荧光共振能量传递FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) Yeast two-hybridization 酵母双杂交：蛋白质相互作用的筛查方法 以特定蛋白为钓饵，筛选其相互作用蛋白 Phage display library 蛋白质相互作用的筛查方法 免疫共沉淀 特定蛋白对相互作用的分析方法 FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer荧光共振能量传递 蛋白相互作用的活细胞分析方法 (3) 如何利用蛋白质组学方法进行功能分析？ 蛋白质芯片 抗原－抗体 鉴定蛋白质相互作用 鉴定蛋白质与小分子相互作用：代谢组学 检测酶活性：蛋白质功能的高通量分析 本章的主要内容是什么？ 通过本章学习了解了哪些核酸和蛋白质分析方法？ 什么是分子杂交？ 分子杂交