实时荧光定量PCR原理及其应用.pptVIP

主要内容 荧光定量PCR原理 荧光定量PCR方法与应用 荧光定量PCR定义 在PCR反应体系中，加入荧光集团，利用荧光信号的累积对PCR反应过程实时监控，最终对初始模板进行定量。 Gel-based quantification Real-time quantification 阈值threshold ：在荧光信号指数扩增阶段，在扩增曲线任意位置上人为设定的一个值，一般我们将荧光阈值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。 CT=cycle threshold即阈值循环数：荧光信号达到阈值设定值时PCR所经历的循环数。 荧光定量PCR原理 如何定量 绘制标准曲线 所测样本C(t)值 定量 标 准 曲 线 荧光定量PCR方法 荧光染料法 荧光探针法 应用之一：病原体检测与定量 应用之一：病原体检测与定量 应用之一：病原体检测与定量 两条探针分别针对不同等位基因 试验设计与优化 PCR是精确性很高的实验，实验前我们需要完整的实验设计方案，而且实验条件对结果影响也很大。 PCR扩增效率：保证实验的精确性和重复性。 影响扩增效率的因素：扩增子长度；扩增子GC含量；扩增子、引物、探针二级结构；PCR各组分反应浓度；模板浓度。 引物设计原则 扩增片段100-200bp 引物长度18-30bp，Tm在58-62℃之间，上下游引物Tm值不超过2℃ GC含量在30-80%，避免出现多个重复碱基，3’端不为G或C。 避免引物内二级结构，引物间二聚体出现。 跨外显子设计引物，消除基因组DNA扩增 探针设计原则 Taqman探针长度25-32bp，Tm在68-72℃之间，确保比引物的Tm值大5-10℃ GC含量在30-80%，避免出现多个重复碱基 5’端不能为G，G能淬灭荧光信号 Taqman探针要靠近上游引物，最好只有一个碱基距离。 避免探针与引物间形成二级结构 SNP位点应设计在探针中间位置 实时PCR体系优化 基本参数的优化 MgCl2的浓度，DNA：2-5mM;mRNA：4-8mM。 模板浓度，系列稀释梯度模板，CP在15-30之间。而CP值的确定经验上是SYBRGreen荧光信号是本底的2倍，杂交探针荧光强度是本底的0.3倍。 使用SYBRGreen测定DNA的优化 MgCl2的浓度，2-4mM 模板浓度，DNA：50ng-5pg；质粒：106拷贝 引物浓度，0.3uM 退火浓度，比计算出的Tm小5℃ 使用SYBRGreen进行一步法RT-PCR的条件优化 MgCl2的浓度，4-8mM 模板浓度，总RNA或mRNA：1pg-1ug 杂交探针测定DNA MgCl2的浓度，不要超过2mM 探针浓度，0.2uM 杂交探针进行实施定量RT-PCR MgCl2的浓度，4-8mM之间 探针浓度，0.2uM 模板浓度设置， 1pg-1ug的总RNA或是mRNA 荧光定量PCR仪的硬件条件 荧光定量PCR仪应满足的要求 光源的光谱范围宽广，能激发不同的荧光染料 能分开不同荧光素的激发光与发射光波长 能检测的灵敏度与动态检测范围 准确的温度控制和良好的孔间温度均一性. Mx3000P 整体设计 仪器优势 ?石英卤钨灯的激发光源：超长的激发光范围350-750nm ?多通道设计，滤光片可灵活定制 ?卓越的孔间均一性和温度控制，72℃时+0.25℃ ?光学扫描设计: 避免边缘效应；光电倍增管增加检测的灵敏度 ?内置芯片，具有断电保护功能 ?人性化的软件，实时监测，直观易用，功能强大 ?开放的平台，选择你心仪的试剂与耗材 ?完善的售后支持，您的满意是我们最大的目标 “备”则“倍” 有准备、有规划的人生更精彩！ Thank you！ 选择吉泰，选择成功！ 激发光源 热循环－加热、制冷 样品 检测设备 Stratagene 公司成立于1984年,致力于发展生命科学领域的创新产品与科技. 总部位于美国 La Jolla, California .在欧洲与日本设有分公司. 2007年被Agilent公司收购，成为Agilent公司旗下品牌。 Stratagene 公司简介 热盖 热循环系统 石英卤钨灯 发射光滤镜轮 激发光滤镜轮 光纤扫描臂 1.正确认识自我，尊重自我——人职和谐的基础 2.充分了解职场，努力做到人职匹配 3.适应社会需求与发展，选择最能发挥自己能力特长的职业。 没有最好的职业，只有最适合自己的职业，适合自己的才是最好的。 1.职业生涯开发与管理的观点是：只要开始，永远不晚； 只要进步，总有空间。 2.在职业生涯的道路上，重要的不是目前所处的位置， 而是迈出下一步的方向。 * 实时荧光定量PCR原理及应用 上海吉泰生物科