基因工程与基因体外表达分析.ppt

α 互补的检测 目 录 2、免疫学方法 利用特异性抗体检测表达产物 3、核酸杂交法筛选特定DNA 鸡的β肌球蛋白的克隆和免疫学检测方法 目 录 原位杂交 目 录 Southern印迹 目 录 4、PCR技术对特定DNA进行直接鉴定 5、利用限制性内切酶酶切图谱鉴定DNA hMLCK重组质粒酶切图谱分析 1．未酶切质粒 2. EcoRⅠ酶切 3. Hind Ⅲ 酶切 4．EcoRⅠ/Hind Ⅲ双酶切 5. 250bpDNA Ladder 1、利用TK-细胞突变株进行筛选 转染细胞的抗性标记筛选 TK-细胞 TK+细胞 HAT培养液 不能存活 能存活 A：氨基蝶呤是核苷酸从头合成的抑制物， H：次黄嘌呤可以作为补救合成dATP、dCTP 的底物 T：胸苷它必需在TK（胸苷激酶）作用下生成胸苷一磷酸。 2、药物筛选：新霉素抗性基因 G418是一种氨基糖苷类抗生素 ,它的结构和新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞产生毒素 。当neo基因（新霉素抗性基因）被整合进真核细胞DNA后 , 获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。 第五节 利用重组DNA技术可对 基因进行改造 基因定点诱变 指将基因的某一个或某些位点进行人工替换或删除的过程,称为基因定点诱变. 1、 通过基因定点诱变可以改变蛋白质编码序列的个别密码子，可以改造蛋白质的结构与功能； 2、 通过改变具有调控功能的序列，可以确定DNA特定的功能区域； 3、 构建新的载体或嵌合基因。 一、带突变位点的寡核苷酸可介导定点诱变 二、Kunkel法 三、PCR技术适合进行基因的定点诱变 5` 5` 3` 3` 5` 5` 3` 3` a b c d 5` 3` 3` 5` 变性、退火 5` 5` 3` 3` 加klenow DNA聚合酶 5` 3` 5` 3` 加入引物a、d 5` 3` 5` 3` 3` 5` 3` 利用基因定点诱变可改变基因工程蛋白的特性 　　自然界的蛋白质常具有一定的可塑性，当某种蛋白质中的一些氨基酸被改变或删除后，其理化性质发生了改变，但仍能保存其原有生物活性．同时一些蛋白质相互融合后仍保持各自成分的活性． 　　　因此，通过基因突变而引起蛋白质结构与功能的改变是可行的． 　　　　 １、定点诱变可制备长效胰岛素 　　　①将人胰岛素Ｂ链２７位的Ｔｈｒ改为Ａｒｇ， ②将Ｂ链羧基端氨基化和③Ａ链２１位Ａｓｎ改为Ｇｌｙ后，其胰岛素的等电点从５．４移至６．８，在生理ｐＨ条件下结晶，从而延迟吸收．其在血浆中的半衰期可延长至３５．３小时 ２、定点诱变可制备快速吸收的胰岛素 胰岛素在治疗糖尿病时，吸收非常慢，在注射后1。5至2小时，体内胰岛素还未达到高峰，而且在3-5小时后，其水平仍继续上升。 决定胰岛素在注射部位吸收速度决定于胰岛素结合状态。胰岛素在体内吸收是以单体形式吸收的。而普通的胰岛素在中性情况下多数是与锌结合成六聚体，单体形式非常少。 研究发现多聚体之间形成与其B链的B8、9、12、13、16、23-28位残基有关，因此通过基因突变改变上述位置的氨基酸残基，可减少多聚体形成，提高吸收率。 3、通过基因诱变能增加胰岛素与受体的亲和力 通过对胰岛素结构模型分析，发现胰岛素与受体的结合是有特定空间结构的，因此通过基因诱变，改变一些氨基酸残基的组成，会增加其与受体的亲和力。 第六节 克隆基因在适当宿主细胞内表达 一、在大肠杆菌表达系统 （一）、在大肠杆菌系统表达外源基因需要一些基本要素 1、来自真核细胞目的基因需要改造 2、必须选择用大肠杆菌载体 3、注意目的基因连接在起始密码子之后：表达产物有融合蛋白和非融合蛋白两种（NdeⅠ：CATATG；NcoⅠ：CCATGG） 4、选择适当的受体菌株和诱导条件 1、融合蛋白较稳定； 2、如果载体携带的一段编码信号肽的基因片段，可产生分泌型产物； ３、可利用融合蛋白中原核蛋白制备的单抗进行亲和层析，便于纯化； ４、可利用融合蛋白中原核部分与表达蛋白之间加入的蛋白酶切位点，可切除原核部分。 表达融合蛋白优点： （二）、提高外源基因表达水平 1、提高外源基因表达水平：启动子结构；调整SD序列与ATG之间距离；用点突变的方法改变某些碱基；增加mRNA的稳定性 2、将细菌生长与外源基因的表达在时间上分开：减轻细胞的代谢负荷 3、采用不同措施提高表达蛋白的稳定性：表达融合蛋白；采用某种突变菌株；表达分泌蛋白； 二、真核表达系统 利用真核细胞作宿主表达系统的优点