重组痘病毒重点解读.docVIP

痘病毒（MVA）的扩增 TCID50测定 铺96孔板，每孔100μl，约1×103 -5×103个细胞； 将病毒作一系列稀释 取150μl病毒液，加入1350μl 2%维持液，即稀释度为10-1 再从上一稀释液中取150μl，加1350μl 维持液，即为10-2 以此类推， 10-6 每孔各加100μl病毒稀释液，总体积为200μl，其中，1，2两孔只加2%维持液； 37℃培养5天左右，每日观察CPE； 计算 稀释度 10-1 A 100 10-2 B 100 10-3 C 91.6 10-4 D 40 10-5 E 0.7 10-6 F 0 Reed-Muench两氏法 距离比例=（高于50%病变率的百分数-50%）/ （高于50%的百分数-低于50%的百分数） Eg.=（91.6-50）/（91.6-40）=0.8 Lg TCID50=距离比例×稀释倍数的对数+高于50%病变率的稀释度的对数=0.8×（-1）+（-3）=-3.8 TCID50=10-3.8 /0.1ml 含义：将该病毒稀释103.8接种100μl可使50%的细胞发生病变。重组痘病毒的筛选 感染与转染 将痘病毒感染BHK-21细胞后，再转染质粒，37℃培养2天。 转染前一天铺6孔板，每孔约1×105个细胞，次日可达50-80%的汇合率； 弃培液，将MVA用2%的维持液稀释，每孔加500μl（MVA的量为0.1pfu/cell，即取100μlMVA稀释至500μl），37℃放置1-2小时，间隔30分钟轻轻晃动，使病毒充分吸附； 在吸附的后一个小时中，准备转染复合物； 用无血清培液稀释fugene6，培液中不加抗生素，总体积为100μl，即97μl培液中加3μl fugene6，轻轻混匀，室温放置5分钟； 注：将fugene6直接加到培液中，勿碰到管壁。 将质粒DNA加入到稀释过的转染试剂中，fugene6：DNA=3:1，即DNA加1μg，轻轻混匀，室温放置20分钟; 将此复合物逐滴加到细胞中，摇晃均匀，37℃培养2天。 第一轮gpt筛选 通过反复冻融法裂解细胞，释放病毒； 将此收获的病毒再次感染细胞（其中1ml感染9cm dish，另1ml-80℃冻存），37℃放置1-2小时，间隔30分钟轻轻晃动，加入10ml gpt筛选培养基，37℃培养2天。 第二轮gpt筛选 反复冻融裂解细胞，释放病毒； 将病毒液做系列稀释，取出100μl、10μl、1μl病毒液，补加维持液至1ml，然后再去感染细胞，9cm dish； 1-2小时后加入gpt筛选培养基，其中含0.9%的agarose，一定要将agarose solution（含gpt）冷却至37℃，再沿着壁加到细胞上，37℃培养3天。（第一层胶） 中性红染色 将2×MEM和1.8% agarose等量混合，37℃温育，然后加入1/10的0.1%中性红，取其中3ml加到9cm dish中，让agarose在室温下凝固，然后再放入37℃培养箱中培养，几小时后，细胞即被染色。（第二层胶） 挑选空斑 用200μl枪头挑3-6个空斑再去感染单层细胞（24孔板），加入gpt筛选培养基，37℃培养2天。 再次纯化 反复冻融裂解细胞，释放病毒，再次感染细胞（9cm dish），加入2%的维持液，这次不必用gpt筛选培养基了。 扩增重组病毒及TCID50测定 阳性重组体的检测 PCR、western blot法检测HCMV的gB和IE1是否成功插入痘病毒载体中，由于没有gB和IE1的抗体，需构建质粒，免疫老鼠，取小鼠的血清，作为多抗。