实验室常用实验方法要点分析.docVIP

总RNA的提取Trizol法提取在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。 提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打以裂解细胞； 将上述组织或细胞的裂解液转入EP管中在室温下放置5分钟； 在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟； 取上层水相置于新EP管中按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟； 弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清； 让沉淀的RNA在室温下自然干燥； 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。 PCR 实验室常用聚合酶有三种：TaKaRa TaqTM，TaKaRa EXTaqTM和Pyrobest