免疫研讨.docVIP

丁酸钠促进鼠骨髓分化间充质干细胞光滑通过组蛋白乙酰化作用肌肉细胞 摘要 建立一个有效的方法来提高干细胞分化是至关重要的干细胞移植。我们旨在探讨是否和钠丁酸(NaB)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(msc)分化成膀胱平滑肌细胞(smc)。我们发现,NaB显著抑制MSC增殖,促进了MSC分化SMC,增强的SMC特定基因的表达细胞。培养的msc与smc transwell系统促进了分化的细胞为smc。NaB再次提升MSC分化系统。此外,NaB增强SMC的乙酰化作用相关的基因H3K9和H4,减少HDAC2和衰减的表达招聘HDAC2 SMC特定基因的启动子区域。最后,我们发现,NaB显著促进了MSC去极化,增加了细胞内钙水平的msc在卡巴可刺激。这些结果证明NaB有效促进MSC分化成smc,可能的显著抑制HDAC2表达式和分裂HDAC2招聘SMC特定基因在细胞,进一步诱发高水平H3K9ace H4ace和增强的目标基因的表达,而这策略可能应用于临床组织工程和细胞移植。 介绍 细胞生长试验’(向前)和5’-CGCCGATCCAGACAGAATATTTG-3’(反向);calponin:5’-CCCACAATCACCACCCACACAAC-39(向前)和5’ -CCTCGGCCTGATCTCCCCAAACT-3’(反向);SM-MHC:5’ -GAGGAGGCGGTGCAGGAGTGTAG-3(向前)和59 -GGCGCTGGTGTCCTGCTCCTT-3’(反向)和b-actin:5’ -TGGTGGGAATGGGTCAGAAG-3’(向前)和5’ -ACGCACGATTTCCCTCTCAG-3’(反向)。退火温度是60°C。每个值代表了至少三个独立实验的平均水平。 免疫印迹分析 冰冷的PBS的细胞被洗了三次,细胞溶解在钠十二烷基硫酸(SDS)溶菌作用缓冲和离心,收集上清。一个共有15毫克蛋白是10%聚丙烯酰胺凝胶和加载和分离转移到硝化纤维膜。阻塞后,膜以下主要抗体:孵化anti-a-SMA(∶Abcam),anti-calponin(1:20000 Abcam),anti-SM-MHC(1:1000 Abcam)anti-HDAC1(1:1000微孔)和anti-HDAC2(1:1000微孔)。膜是然后开发一个增强化学发光试剂(发射极耦合逻辑;Amersham,美国新泽西州皮斯卡塔韦)。相同的样本进行了分析与anti-mouse b-actin抗体作为蛋白质控制加载。 染色质免疫共沉淀 染色质免疫沉淀反应芯片(芯片)进行使用分析工具(微孔)。总之,16107细胞用1%甲醛固定10分钟室温。交联的DNA被剪切长度200 - 500个基点声波降解法。抗体芯片级acetyl-histone H3K9(5毫克,Abcam),acetyl-histone H4(5毫克,微孔),HDAC1(1毫克,Abcam)和HDAC2(1毫克,Abcam)孵化与每个免疫沉淀反应反应在4°C过夜。正常大鼠免疫球蛋白g(5毫克,Abcam)作为消极的控制。后可逆交联,使用qPCR DNA纯化和分析。的ChIP-qPCR数据归一化到正常大鼠免疫球蛋白g控制在每一个实验。引物序列如下:a-SMA:59 -CCGCAGTTACAGTGATTC-3’(意义)和5’-GCTAAGGGCTTGAGATGA-39(275个基点),anti-sense calponin:5’-CAGTCAGCTCCCAATACCAA-3’(意义)和5’-TTCCAAGCCTGTCCCATT-3’(anti-sense,112个基点),SM-MHC:5’-CAGATCCGTACAGGGCTAA-3’和5’-TGCCTGGGACCAATAAC-3’(反义179个基点)。退火温度是60°C。 细胞内钙离子成像 细胞培养在35毫米激光共焦培养皿和满载Fluo-8 /我(2.5毫米;AAT Bioquest,Inc .)、美国)在室温下1 h在黑暗中。洗两次D-Hank的解决方案后,细胞内钙离子的变化这些样本记录使用显微镜系统。Fluo-8是兴奋490海里,荧光发射测量在514海里。这些细胞被不断与D-Hank过冷的解决方案。在2 -图像获得的第二间隔治疗期间与碳酰胆碱和高钾。的数据表示为F / F0,F是绝对的花期和F0值吗基线。 统计分析 我们使用三个或四个老鼠为每个实验池和混合从这些老鼠细胞,这些细胞和分布式分成三个平行井。每一个实验重复三次。数据显示的结果三个独立的实验之一,作为一项意味着SD。比较两组使用t或单向方差分析,超过两组之间和比较了使用图基的Posthoc分析。数据分析使用GraphPad Prism 5.0(GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。P值,0.05被认为是具有