抑制消减杂交的原理及应用资料.pptVIP

抑制消减杂交的原理及应用 尚 立 娜 主 要 内 容 抑制消减杂交的定义 抑制消减杂交的原理 抑制性消减杂交技术的定义： 是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术.其原理是以杂交二级动力学和抑制性PCR反应为基础的cDNA消减杂交技术.通过合成两个不同的接头，连接于测试cDNA片段的5’末端，达到选择性扩增差异性表达的cDNA片段，抑制非目的cDNA的扩增.该技术与其他消减杂交技术相比 假阳性率低、敏感性高、效率高等优点而得到广泛应用. 抑制消减杂交的原理 杂交二级动力学原理：即丰度高的单链DNA在退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，从而使原来在丰度上有差别的单链DNA相对含量达到基本一致。 抑制PCR原理：利用链内退火优于链间退火的特点，使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法作为模板与引物配对从而选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。 巢式PCR反应：巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物，结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异性