基于载体的RA干扰技术.docVIP

Biochemical and Biophysical Research Communications《生物化学与生物物理学研究通讯》 RNA干扰转基因斑马鱼肌肉抑制基因双肌肌肉生长抑制素属于转化生长因子（TGF）-β超家族，骨骼肌的和。我们利用显微注射反义RNA的表达载体，一个肌肉生长抑制基因遗传稳定的斑马鱼。实时PCR和免疫显示，在纯合的转基因斑马鱼肌肉生长抑制RNA和蛋白分别33％和26％。此外，转基因鱼肌细胞生成素Mrf4和Myf5生肌调节因子mRNA水平非转基因升高。虽然在长显著差异，纯合的转基因斑马鱼非转基因45％。组织化学分析表明，纯合转基因鱼的肌纤维的横截面积是非转基因两倍。这是第一个稳定遗传双肌表型。 McPherron和Belgian Blue和Piedmontese 这两种牛中发现了对肌肉的生长具有负调节肌肉调节肌肉生长抑制一般在骨骼肌表达，属于转化生长因子（TGF）-β超家族，拥有家共同结构。在牛和小鼠的基因。此外，类似的的表达。 在成年哺乳动物，主要靶组织。然而，随后研究发现肌肉生长抑制素乳腺、心脏脾脑较低水平的表达，它会影响心肌生长以及脂肪细胞分化。由于子宫内进行困难，哺乳动物胚胎表达模式大多仍不清楚。在早期，体节中胚胎发育 肌肉生长抑制素不仅抑制骨骼肌生长，维持组织稳态增长渗透压调节生殖功能也起着重要作用相比于哺乳动物，在不同品种鱼类的胚胎许多定性和定量的表达在斑马鱼中，发现两种形式（和）的基因。肌肉生长抑制素RNA是48小时的胚胎中表达达到最高8-体节阶段组织表达谱，基因广泛表达肌肉，大脑，眼睛，肾脏，睾丸，卵巢，消化道和心脏，但基因表达谱比较有限，大都局限于大脑。只有的基因是在过程中动态调节，而基因。 肌肉生长抑制素骨骼肌生长负调节。同源基因小鼠骨骼肌明显比野生型（WT）小鼠的，由于细胞数量（增生性增长）和细胞大小（肥厚性增长）肌肉小鼠2到3倍以上的。在哺乳动物中，RNA 干扰RNAi）技术通常用来获得基因动物在鱼类中，一些研究肌肉生长抑制素斑马鱼报告。Amali等注射反义发现体节的数量和大小在这一增加。他们还，肌肉相关myogenin）基因转录的上调。Xu等过度表达的转基因斑马肌肉细胞数量仅略有增加，仅在雌鱼Acosta 等通过显微注射的双链RNA 到斑马鱼的卵“巨斑马鱼” 虽然难以确定或的上述研究这些研究表明，鱼类的生物功能可能不仅限于骨骼肌生的负调控。 由于目前在鱼类还没有基因敲除技术，没有稳定基因抑制，我们使用基于RNA干扰方法获得稳定的基因敲除模型鱼研究肌肉生长抑制素的功能。这是第一个斑马鱼基因的表达和功能 材料和方法 鱼的饲养 斑马鱼（斑马鱼类）是从本地水族用品店。在28 20 -L的光照强度以及14h:10h的日/夜周期显微注射受精卵光期单细胞阶段。 反的构建 （ AY687474）从斑马鱼cDNA文库（Stratagene公司）。为了便于跟踪转基因的表达，包含810个碱基对的斑马鱼编码区的DNA 片段，反克隆到pEGFP - C1载体（Clontech公司）的EcoR位。 斑马鱼胚胎的显微注射和转基因斑马鱼 每个单细胞期胚胎玻璃微吸管约200微微升质粒DNA（150微克/毫升）。荧光显微镜（Leica, MZFLⅢ）转基因胚胎的绿色荧光观察和记录转基因斑马鱼这些GFP阳性们性成熟非转基因鱼。 实时逆转录聚合酶链反应（RT - PCR技术） 斑马鱼孵化期胚胎RNA提取TRIZOL试剂盒（nvitrogen公司）。对于RNA样品分析，高容量cDNA反转录试剂盒（Applied Biosystems公司），采用随机引物反转录。实时PCR：95 10min；95 ℃15s、60℃1min，40个循环，使用2 ×SYBR Green PCR Master Mix预混液（Applied Biosystems）500nM浓度的正反引物。每检测Applied Biosystems7300型实时PCR，表达的变化，是用比较法。 值EF1α作为内。一步PCR法（Life technologies）使用RNA（250纳克）从孵化阶段的胚胎中提取。内EF1α，并在相同的PCR扩增 。PCR反应程序：60 ℃30min、95℃30s；95℃30s、60℃1min、72℃1min，25个循环，所有Applied Biosystems 2720型热循环仪PCR产物2％琼脂糖凝胶电泳。 引物序列 EF1α的前引物为5 - GGT GAG TTT GAG GCT GGT ATC TCC AAG AAC -3，后引物为5 - GAA GCC AAC GTT GTC ACC AGG AGT GGC CTC - 3；肌肉生长抑制素Ⅰ的前引物为5 - GCA TGT GGT CCA GTG GGT TAT - 3 ，5