聚合卵巢的肾囊移植手术操作重点分析.docVIP

供体细胞的聚合操作 青岛农业大学动物生殖发育与基因工程研究所 陈波 flamingcb@163.com 1、在聚合前，先平衡铺有琼脂的30mmα培养皿：在α培养皿中铺上一层薄薄的琼脂，待琼脂后，向其中加入1ml 含10% FCS的αMEM培养液，放入37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中。如此反复洗3次，每次15min。 2、把待聚合的细胞混合均匀，转移到0.5ml离心管中（注意用培养液洗下平皿），3500rpm，离心3min，弃上清。 3、加入400μl BSA培养液细胞，3500rpm，离心3min，弃上清，尽量把上清吸干净。 4、加入BSA培养液100μl，加入0.02g植物凝集素，使其终浓度为0.2mg/ml，37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱平衡10min，平衡过程中震荡数次。 5、12000rpm，离心10s，将离心管旋转180°，12000rpm，离心30s。 6、用刀片削去一部分，以便能吸入把离心管中的组织块用枪吸到平衡好的30mm α培养皿中，加入适量含10% FCS的αMEM培养液在保证组织不至于悬浮在培养液中的前提下尽量多加一些——这点很重要将培养皿倒置放入37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱培养。 7、培养24h后的聚合卵巢会开始渐渐聚拢，形成圆饼状；培养48h后的聚合卵巢则形成圆球形，明显高出培养液液面，边缘形成清晰的界面，用镊子可以反复夹起而不变形。聚合的卵