Western_blot_试剂配制及操作流程介绍.docVIP

Western-Blot操作流程 试剂配制 蛋白提取试剂 RIPA裂解液： 50mM Tris（MW121.14，PH7.5） 3.02g 150mM NaCl 4.38g 1%TritonX-100 5ml 1%脱氧胆酸钠 5g 0.1%SDS 0.5g 蒸馏水至 500ml。 调pH值至7.5。 混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。 2. 蛋白酶抑制剂cooktail 所需母液成分： （1）100mmol/L PMSF PMSF 17.4mg 异丙醇 1ml 溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。 （2）10mM 亮肽素leupeptin: -20℃保存 （3）2.1mg/ml 抑肽素Aprotinin: 4℃保存 配制： 成分 终浓度 每ml裂解液所加母液量 PMSF 1mmol/L（储存浓度稀释100倍） 10ul Leupeptin 0.1mmol/L（储存浓度稀释100倍） 10ul Aprotinin 1ug/ml （储存浓度稀释2000倍） 0.5ul 各成分直接加入所用的RIPA裂解液中 ，之后按照60ul/孔（12孔板）提取蛋白。 蛋白定量试剂 1. G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用） 考马斯亮蓝G250 100mg 95％乙醇 50ml 85％磷酸 100ml 蒸馏水至 1000ml 配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存于棕色瓶中。 2．牛血清白蛋白BSA储存液（1mg/ml）： 100mg BSA粉末溶于20 ml双蒸水，定容至100 ml，加少量防腐剂，4℃保存。 上样用试剂 1．4X上样缓冲液 1.0 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2ml SDS 0.8g 溴酚蓝 0.04g 甘油 4ml 去离子水定容至10ml。混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。使用时稀释成1X。 2．1.0 mol/L二硫苏糖醇（DTT）（10X） 用20 ml 0.01 mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT,分装成1ml小份储存于-20 C。使用时稀释成1X。 例如：上样量20μl--4X上样缓冲液 5μl+ DTT 2μl + 样本蛋白13μl 工作液 制胶用（1-6）： 1.0mol/L Tris·HCl （pH6.8） Tris MW121.14 12.114g 蒸馏水 100ml 溶解后，（用浓盐酸调pH至6.8），室温下保存。 1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8） Tris MW121.14 18.171g 蒸馏水 100ml 溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。 10％SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml 如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。 如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g 蒸馏水 1ml （现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周） 四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4 C保存。 30%丙稀酰胺： 4 C保存。 10%下层胶（两块胶，15ml）： 依次加入 去离子水 5.9ml 30%丙烯酰胺 5ml 1.5M Tris-HCl（pH8.8） 3.8ml 10%SDS 150μl 10%AP 150μl TEMED 6μl 每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。灌胶后加正丁醇（1ml）消泡 5%上层胶（两块胶，6ml）： 依次加入 去离子水 4.1ml 30%丙烯酰胺 1ml 1M Tris-HCl（pH6.8） 0.75ml 10%SDS 60μl 10%AP 60μl TEMED 6μl 每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。 5X电泳液缓冲液 Tris（MW121.14） 15.1g 甘氨酸（MW75.07） 94g SDS 5.00g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。 10X转膜缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至20%。 通常取80ml母液，加560ml蒸馏