A1_核酸化学_DNA2004.pptVIP

复旦大学生物化学系 黄伟达 DNA的分子杂交技术 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 聚合酶链反应（PCR）原理 PCR是应用最广的分子生物学技术，在DNA测序中只用了单链扩增技术，所产生的模板DNA并不指数上升，而只以热循环数为倍数。 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 足迹法原理(Footprinting) * 复旦大学生物化学系 黄伟达 利用足迹法确定 RNA 聚合酶结合位点的实验 * * * * * 黄伟达 复旦大学生物化学系 黄伟达 DNA的结构与特性 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 Watson-Crick的DNA双螺旋 2.0 nm 结构特征 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 双螺旋分子中糖分子与纵轴平行，与碱基平面垂直 稳定双螺旋结构的作用力为氢键和碱基堆积力（即疏水作用） * 复旦大学生物化学系 黄伟达 DNA的分子形状 原核生物的基因组DNA（即染色体）、质粒（plasmid）DNA，和一些病毒DNA，呈环状。 真核生物的染色体DNA，大部分噬菌体DNA，和一些病毒DNA，呈线状。 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 环状DNA引发的拓扑学问题 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 细菌质粒DNA的不同状态 松弛型 超螺旋 部分解链 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 正螺旋和负螺旋 DNA双螺旋为右旋螺旋。细胞中的环状DNA一般呈负超螺旋，即右旋螺旋不足导致部分碱基不形成配对，分子通过整体拓扑学上的右旋来补足右旋螺旋的不足，在数学上呈1：1，即分子整体右旋一圈来补双螺旋上的一圈不足。 正超螺旋为双螺旋旋转过度，通过分子整体的左旋来解去过度的螺旋。 正超螺旋 左旋 负超螺旋 右旋 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 不同形状的DNA分子在琼脂糖中的迁移率 松弛型，OC, Open circular DNA 超螺旋, CCC, covalently-closed circular DNA Linear DNA 从细菌抽提得到的质粒DNA 样品中不含线状DNA * 复旦大学生物化学系 黄伟达 从大肠杆菌用常规方法得到的质粒DNA经常是这个样子 ? 电泳方向 线性化前 线性化后 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 DNA复制过程中形成的链状分子(catenanes) 需要拓扑酶来帮助解离 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 真核生物的DNA不裸露 平均每200bp的DNA绕核小体左旋1.75转，因此真核生物的DNA分子为正超螺旋 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 DNA的一级结构分析 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 DNA的序列测定（1）－－化学法 Maxam /Gilbert法 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 DNA的序列测定（2）－－ddNTP法 Sanger法 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 DNA测序结果 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 到2030年，预计只要1000美金就能得到个人的基因组序列。刷卡看病的时代即将到来。 注： 人与人之间平均 1000个碱基对就有一个碱基呈多态性(SNP)。因此共在300 万个碱基上可能存在差异。 SNP：single nucleotide polymorphism * 复旦大学生物化学系 黄伟达 DNA重组技术的基础 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 DNA与限制性内切酶 双链DNA分子可以被上千种从微生物中分离得到的限制性内切酶（restriction enzyme）切断, 又可以再连接起来。切断的过程不需要能量，而连接的起来的过程却需要2个分子的ATP。这就是分子克隆和DNA重组技术的基础。 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 大部分限制性内切酶识别的碱基序列均为 6 个碱基的palindrome 顺序。它们在微生物细胞内扮演的却是防御外来DNA入侵的国防军的作用。如何不把自身的DNA也降解了呢？ * 复旦大学生物化学系 黄伟达 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 DNA重组示意图 EcoRI与DNA的复合体 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 DNA的变性与复性 人基因组中重复序列的发现 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 ＤＮＡ分子的变性 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 DNA的变性在紫外吸收上的变化 1.37倍 Hyperchromic effect 增色效应 1 OD260 DS DNA 50 ?g SS DSA 37 ?g RNA 40 ?g 不同来源DNA的变性曲线 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 盐浓度对DNA变性的影响 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 DNA分子的Tm与GC含量有关 * 复旦大学生物化学系 黄伟达 DNA浓度与复性时间的关系 T1/2 × C ＝ const * 复