无菌检查法及其验证材料.pptVIP

样品处理 主要强调固体样品的溶解、转移、均匀分配问题。通常将规定取样量全部转移到400～500ml稀释剂或者适宜溶液，再进行分配。 冲洗方法 强调少量多次：50ml/次； 强调充分振摇； 操作细节的标准规范，如集菌仪转速、冲洗过程中盖还是不盖滤筒下口等等。 菌液加入 菌液组、供试品加菌液组严格一致。 无菌检查法验证实验要点 中和剂加入 不同中和剂加入方式可能效果不一样。直接加入培养基中效果最好。但如果某些中和剂对微生物生长不利可考虑其他步骤加入。 菌液加入 按规定应在最后一次冲洗液中加入阳性菌液，主要是考虑过滤器的有效性。而验证实验主要考虑滤膜/滤器残留抗菌物质对阳性菌生长的影响，可以与对照滤筒比较而做出判断，所以验证实验中加菌时机与方式只要与对照一致即可。 无菌检查方法验证 通过验证最终确定：样品检验量，稀释液类型、用量及样品浓度，薄膜过滤器类型，冲洗液类型及冲洗次数，酶的浓度、加酶量及加酶方式，阳性对照菌，培养基生产单位、配制、消毒及用量，培养温度与时间等。 无菌检查方法验证 为了考察检验方法的稳定性和重现性，验证时，至少需准备3个不同批次的同类样品，3名不同实验人员分别进行3次验证试验。 一旦验证合格，无菌检查方法必须严格按照验证合格的程序进行，涉及到培养基的生产单位、配制、灭菌及用量，稀释液、冲洗液的种类、配制、灭菌及用量，青霉素酶的浓度、加入量、加入方式，菌液制备及计数方式，集菌器的规格型号、生产单位，集菌仪，培养温度，培养时间等均应与验证时所用的仪器设备及物料一致。 验证试验应注意的问题 样品的选择（是否有抑菌性） 样品必须无菌合格 供试液浓度的选择（浓度不能太高） 充分振荡 试验菌株测试的顺序（先验证敏感菌） 菌液的加法（最后一次冲洗液加入） 培养基的用量 三次平行试验 验证试验记录 总的要求：详细、严谨、可操作性 供试品信息 检验数量和检验量：按照无菌检查的量确定 供试品处理、供试品溶液的制备 检验方法（选择直接接种法说明理由） 实验用菌：代数、稀释级、计数 培养基信息 检验条件：主要是冲洗条件（冲洗液、冲洗次数、量，必要时说明滤膜材质、仪器、泵速等条件）。 需要中和、酶处理等特殊处理方法的需说明 逐日记录各菌的生长情况 验证试验结论 采用的方法：薄膜过滤法/直接接种法 供试品检验量及处理、制备情况 关键实验点：如冲洗条件、中和、酶处理等因素。 阳性对照菌的选择 薄膜过滤法加菌的时机 按规定应在最后一次冲洗液中加入阳性菌液，而验证试验主要考虑滤膜/滤器残留抗菌物质对阳性菌的生长的影响，可以与对照滤器比较而作出判断，所以验证试验中加菌时机与方式只要与对照一致即可。 验证及资料中常见的问题 薄膜过滤法滤膜材质选择 普通滤膜 有机膜 低吸附滤膜 1.根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。 2.应保证滤膜在过滤前后的完整性。 3.采用全封闭过滤器注意观察膜的状态，某些油性供试品或采用蓖麻油等作为溶媒的供试品可以损伤普通滤膜。 敏感菌株与阳性对照菌 阳性对照菌不是验证试验选定的敏感菌株 问题：降低了阳性对照菌的意义，实际工作中抑制枯草芽孢杆菌的样品很多（敏感菌株），但阳性对照只能选择金黄色葡萄球菌。 稀释液选择的问题 药典附录无菌检查法规定的稀释液和冲洗液只有2种，即0.1%蛋白胨水溶液和PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液。但各药品项下却规定用0.9%的氯化钠溶液做为稀释液，采用经验证合格的适宜的溶液作为稀释剂、冲洗液。 理论上使用0.1%蛋白胨水溶液和PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液做为稀释液和冲洗液效果更好，因为这2种溶液具有修复已损伤的微生物的作用，可以提高检出率。 薄膜过滤法和直接接种法 如：一般供试品（无特殊说明）采用直接接种法某厂家胸腺五肽注射液为普通注射剂，完全可以采用薄膜过滤法，生产单位进行的无菌检查验证法为直接接种法。 也有的厂家把两种方法的验证都写上，结论中也没有说明采用那种方法。 无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法，只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。 修订：改为薄膜过滤法重新进行验证。 问题：方法选择错误 问题：冲洗条件、冲洗量的选择 有些验证资料中，对非抑菌性供试品也采用大量的冲洗，100ml/次*10次/膜，增加了出现误差的机会。 1. 对膜的损伤 2. 检验方法繁琐，大大增加检验人员的工作量（检验要按照已经验证的方法进行） 3. 验证试验方法选择总的原则是由易到难 冲洗不一定为100ml/次，可少量多次，如50ml/次，注意充分振摇。 对于抑菌性较强的供试品，可以先用适宜的稀释液稀释后再过滤，以减少膜的吸附, 减少冲洗量。如：抗生素品种取规定量，混合至含适量稀释液（如500ml等)的无菌容器中，然后再过滤。 对于抑